Praca pochodzi z serwisu www.e-sciagi.pl <<<>>> Zacznij zarabiać http://partner.e-sciagi.pl

Metoda Grama

Barwienie bakterii metodą Grama (zobacz schemat) pozwala wyodrębnić dwie zasadniczo odmienne grupy bakterii.

Jakkolwiek sama metoda barwienia wykorzystuje różnicę w budowie ściany komórkowej bakterii, to tak się szczęśliwie składa, że bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne różnią się pod wieloma innymi względami.

Nie wszystkie obecnie poznane bakterie możemy bezpośrednio zaklasyfikować do bakterii Gram-dodatnich lub ujemnych. Należą do nich np. mykoplazmy (Mycoplasma), które nie posiadają ściany komórkowej.

Ponadto niektóre bakterie bardzo słabo wybarwiają się metodą Grama i w związku z tym do ich identyfikacji nie stosuje się tej metody barwienia. Tak się dzieje w przypadku

·          ·          mykobakterii (Mycobacterium), które określamy je jako kwasooporne, gdyż raz zabarwione fuksyną karbolową, nie odbarwiają się pod wpływem kwaśnego alkoholu (95% ETOH, 3% HCl) . Bakterie te barwi się metodą Ziehl-Nielsena.

·          ·          krętków (Treponema, Borrelia)

Należy także pamietać, że bakterie, których nie zaliczamy do bakterii Gram-dodatnich, także mogą się wybarwiać na niebiesko. Przykładem są archebakterie (pseudomureina). Podobnie, ze względu na obecność ściany komórkowej, Gram-dodatnio wybarwiają się niektóre komórki eukariotyczne np. drożdżaków Candida i Saccharomyces (co mogliście zaobserwować na ćwiczeniach).

Poniżej podane są rodzaje bakterii zaliczane do Gram (+) lub Gram (-)

kolorem czarnym oznaczone są te bakterie, w przypadku których nie używa się do identyfikacji metody Grama.

* gwiazdką oznaczone są bakterie Gram-zmienne

Gram-chwiejność

Zjawisko Gram-chwiejności dotyczy głównie bakterii Gram-dodatnich z rodzaju Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionibacterium.

Pewne gatunki bakterii rosnąc w „starej” hodowli (poźne fazy wzrostu, zwykle około 8-10 godz.) tracą swoją cechę barwliwości. Dzieje się tak na skutek wyczerpania się w pożywce składników niezbędnych do syntezy ściany komórkowe (są to dla bakterii warunki stresowe). Podobnie zachowują się bakterie podczas podziału (etap wytwarzania przegrody podziałowej).

Bakterie Gram-zmienne (Gram-chwiejne) oznaczone są gwiazdką

Metoda Grama

Metoda barwienia bakterii wprowadzona w 1884 r. przez duńskiego lekarza Hansa Grama. Metoda Grama polega na barwieniu fioletem krystalicznym, bejcowaniu jodem, odbarwianiu alkoholem i podbarwianiu fuksyną zasadową, co pozwala na podział bakterii na dwie grupy: takie, które zatrzymują odcienie barwnika podstawowego (fioletu krystalicznego) - bakterie Gram-dodatnie i takie, które podbarwiają się barwnikiem kontrastowym (fuksyna) - bakterie Gram-ujemne.

Barwienie bakterii metodą Grama pozwala wyodrębnić dwie zasadniczo odmienne grupy bakterii. Metoda barwienia wykorzystuje różnicę w budowie ściany komórkowej bakterii.

Nie wszystkie obecnie poznane bakterie możemy bezpośrednio zaklasyfikować do bakterii Gram-dodatnich lub ujemnych. Należą do nich np. mykoplazmy (Mycoplasma), które nie posiadają ściany komórkowej. Ponadto niektóre bakterie bardzo słabo wybarwiają się metodą Grama i w związku z tym do ich identyfikacji nie stosuje się tej metody barwienia. Tak się dzieje w przypadku:

-          -         mykobakterii (Mycobacterium), które określamy je jako kwasooporne, gdyż raz zabarwione fuksyną karbolową, nie odbarwiają się pod wpływem kwaśnego alkoholu (95% C2H5OH, 3% HCl) . Bakterie te barwi się metodą Ziehl-Nielsena.

-          -         krętków (Treponema, Borrelia).

Należy także pamiętać, że bakterie, których nie zaliczamy do bakterii Gram-dodatnich, także mogą się wybarwiać na niebiesko. Przykładem są archebakterie (Pseudomureina). Podobnie, ze względu na obecność ściany komórkowej, Gram-dodatnio wybarwiają się niektóre komórki eukariotyczne np. drożdżaków Candida i Saccharomyces.

Gram-zmienność (chwiejność)

Zjawisko Gram-chwiejności dotyczy głównie bakterii Gram-dodatnich z rodzaju Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionibacterium.

Pewne gatunki bakterii rosnąc w „starej” hodowli (poźne fazy wzrostu, zwykle około 8-10 godz.) tracą swoją cechę barwliwości. Dzieje się tak na skutek wyczerpania się w pożywce składników niezbędnych do syntezy ściany komórkowe (są to dla bakterii warunki stresowe). Podobnie zachowują się bakterie podczas podziału (etap wytwarzania przegrody podziałowej).

Działanie czynników, które zaburzają proces syntezy ściany komórkowej (np. penicylina) bądź uszkadzają ścianę komórkową (lizozym) powoduje, że bakterie Gram-dodatnie barwią się ujemnie.

Sposób wykonania oznaczenia

·         ·        Nanieść bakterie na szkiełko podstawowe.

-W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej wystarczy nanieść na szkiełko kroplę hodowli lub pobrać odrobinę bakterii jałową ezą (czyli wyżarzoną w płomieniu palnika) i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka.

- W przypadku wykonywania preparatu z bakterii wyrosłych na podłożach stałych należy materiał pobrać jałową ezą,  następnie zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej naniesionej na szkiełko podstawowe.

Zabiegi te mają na celu przygotowanie bakterii w postaci niezbyt gęstej zawiesiny. Po wysuszeniu utrwalić preparat przez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika. Należy uważać, żeby nie trwało to zbyt długo i żeby bakterii nie przypalić!!!

·       ·       Na utrwalone bakterie nakroplić fiolet krystaliczny w ten sposób by pokrył on powierzchnię, na którą naniesiono bakterie. Barwnik pozostawić na 2 minuty. Po tym czasie zmyć fiolet wodą destylowaną.

·         ·        Nanieść płyn Lugola na 1-2 minuty. Płyn spłukać obficie najpierw alkoholem etylowym, a później wodą destylowaną.

·       ·      ...