10_Analiza_skladu_tluszczowcow.pdf

10.

ANALIZA SKŁADU

TŁUSZCZOWCÓW

1. Identyfikacja lecytyny

Fosfatydylocholin ę mo Ŝ na zidentyfikowa ć i odró Ŝ ni ć od innych glicerofosfoli-

pidów poprzez wskazanie jej charakterystycznych składników, czyli choliny

i fosforanu. Dzi ę ki tym składnikom, tj.: fosfocholinie o charakterze hydrofilnym,

lecytyna tworzy w wodzie do ść trwałe emulsje. Lecytyna zawiera równie Ŝ kwa-

sy tłuszczowe, ich obecno ść jest charakterystyczna dla wszystkich tłuszczow-

ców, zawiera te Ŝ glicerol, który jest składnikiem wszystkich glicerolipidów.

1.1. Wykrywanie choliny

Zasada:

W ś rodowisku silnie zasadowym lecytyna ulega hydrolizie, uwolnion ą cholin ę

mo Ŝ na zidentyfikowa ć . Cholina jest czwartorz ę dowym kationem amoniowym,

który w tych warunkach rozpada si ę do trimetyloaminy i glikolu etylenowego.

O H -

C H 3

O H

C H 3

H O C H 2 C H 2 N C H 3

C H 3

H 3 C N

H O C H 2 C H 2 O H

C H 3

Trimetyloamina ma charakterystyczny zapach solanki ś ledziowej, który pozwa-

la zidentyfikowa ć obecno ść choliny w fosfolipidach.

Wykonanie:

Przygotowa ć dwie probówki, do których wprowadzi ć :

– do pierwszej probówki 5 kropli etanolowego roztworu lecytyny,

– do drugiej probówki 5 kropli etanolu (próba ś lepa).

Do obu probówek doda ć po 5 ml 20% roztworu NaOH.

Ogrzewa ć około 5 minut we wrz ą cej ła ź ni wodnej. Wydziela si ę lotna trimety-

loamina o charakterystycznym zapachu solanki ś ledziowej, co wskazuje na

obecno ść choliny w analizowanej próbie.

1.2. Wykrywanie fosforanów

Zasada:

Wykrywanie ortofosforanów w zwi ą zkach organicznych, w tym równie Ŝ w fos-

folipidach, jest skuteczne po zmineralizowaniu zwi ą zku. W wyniku spalenia

prób fosforanów organicznych w osadzie pozostaj ą tlenki ró Ŝ nych pierwiast-

ków, tak Ŝ e P 2 O 5 . Wyługowany z osadu bezwodnik kwasu fosforowego, po za-

kwaszeniu st ęŜ onym kwasem azotowym (V) reaguje z molibdenianem amono-

wym, tworz ą c fosfomolibdenian amonowy (NH 4 ) 3 P(Mo 3 O 10 ) 4 ] 2H 2 O, czyli

(NH 4 ) 3 PO 4 12MoO 3 o barwie Ŝ ółtej.

H 3 PO 4 + 12(NH 4 ) 2 MoO 4 + 23HNO 3 ® (NH 4 ) 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ] × 2H 2 O ¯ +

+ 21NH 4 NO 3 + 2HNO 3 + 10H 2 O

Wykonanie:

Do suchego tygla porcelanowego wprowadzi ć 1 ml alkoholowego roztworu

lecytyny, pod dygestorium odparowa ć etanol, podgrzewaj ą c tygiel na płytce

elektrycznej, po czym doda ć 3-krotn ą ilo ść mieszaniny spalaj ą cej KNO 3 /Na 2 CO 3

(w stosunku 2:3) i prób ę stopi ć .

Uzyskany stop rozpu ś ci ć w 2–3 ml gor ą cej wody i przes ą czy ć . Do przes ą czu

doda ć w nadmiarze st ęŜ onego HNO 3 i 2 ml 10% roztworu molibdenianu

amonu. Zawarto ść probówki ogrza ć do wrzenia w ła ź ni wodnej.

W trakcie ogrzewania pojawia si ę Ŝ ółto zabarwiony fosfomolibdenian amo-

nowy, który przy wi ę kszych st ęŜ eniach wytr ą ca si ę w postaci krystalicznego

Ŝ ółtego osadu.

2. Wykrywanie sterydów i karotenów

2.1. Wykrywanie cholesterolu

Zasada:

Cholesterol (zawieraj ą cy wi ą zanie podwójne) pod wpływem st ęŜ onego kwasu

siarkowego ulega odwodnieniu, odł ą czana jest cz ą steczka wody i pojawiaj ą si ę

sprz ęŜ one wi ą zania podwójne odpowiedzialne za pojawienie si ę barwy. W od-

czynie Salkowskiego powstaje kwas disulfonowy bicholestadienu o barwie

czerwonej.

HO 3 S

SO 3 H

W odczynie Liebermanna-Burcharda w obecno ś ci kwasu siarkowego i bez-

wodnika kwasu octowego powstaje zielono zabarwiony kwas monosulfonowy

bicholestadienu. Reakcja ta jest wykorzystywana do ilo ś ciowego oznaczania

cholesterolu w płynach biologicznych.

SO 3 H

W obu reakcjach zachodzi odwodnienie cz ą steczek cholesterolu. Obecno ść ś la-

dów wody uniemo Ŝ liwia przebieg reakcji. Analizy te nale Ŝ y przeprowadza ć ,

u Ŝ ywaj ą c suchych probówek i pipet.

Wykonanie odczynu Salkowskiego:

Przygotowa ć cztery suche probówki zawieraj ą ce po 1 ml chloroformu. Doda ć

do nich:

– 5 kropli 2% chloroformowego roztworu cholesterolu – do pierwszej,

– 5 kropli rozpuszczonego masła – do drugiej,

– 5 kropli lecytyny – do trzeciej,

– 5 kropli oleju – do czwartej.

Wszystkie probówki dokładnie wymiesza ć przez wytrz ą sanie.

Nast ę pnie do ka Ŝ dej próby podwarstwi ć (przez swobodne spłyni ę cie po ś cian-

ce pochylonej probówki) 0,5 ml st ęŜ onego kwasu siarkowego.

Warstwa chloroformowa barwi si ę na kolor malinowy, natomiast dolna war-

stwa wykazuje zielon ą fluorescencj ę .

Porównaj barwy poszczególnych prób, zinterpretuj uzyskane wyniki.

Wykonanie odczynu Liebermanna-Burcharda:

Do suchej probówki zawieraj ą cej 1 ml 2% chloroformowego roztworu chole-

sterolu doda ć 10 kropli bezwodnika kwasu octowego i 1 kropl ę st ęŜ onego

kwasu siarkowego. Wymiesza ć . Pojawiaj ą ca si ę barwa czerwona przechodzi

w barw ę niebiesk ą , a nast ę pnie w zielon ą .

2.2. Wykrywanie hormonów steroidowych

Zasada:

,21-dihydroksy-20-okso, czyli: 11-deoksykortyzol, kortyzol i korty-

zon, w ś rodowisku kwa ś nym reakcji Portera i Silbera z fenylohydrazyn ą tworz ą

3,20- lub 3,21-fenylohydrazony o barwie Ŝ ółtobrunatnej. Grupa 17-oksosteroi-

dów (do której nale Ŝą metabolity m ę skich hormonów płciowych oraz niektóre

nadnerczowe steroidy C19) charakteryzuje si ę obecno ś ci ą grupy ketonowej

przy C17, która w ś rodowisku zasadowym reakcji Zimmermanna daje czerwo-

no zabarwiony produkt kondensacji z m-dinitrobenzenem. Wszystkie estrogeny,

czyli steroidy C18: estradiol, estron, estriol, maj ą w swej strukturze aromatycz-

ny pier ś cie ń A oraz grup ę hydroksylow ą o charakterze fenolowym w tym pier-

ś cieniu, które w obecno ś ci st ęŜ onego kwasu siarkowego i hydrochinonu tworz ą

barwne produkty w reakcji Kobera.

Wykonanie próby Portera i Silbera:

· Przygotowa ć dwie probówki zawieraj ą ce po:

– 0,5 ml 0,005% etanolowego roztworu kortyzolu – w pierwszej,

– 0,5 ml etanolu ( ś lepa) – w drugiej.

Do obu prób doda ć po 1,5 ml 0,065% roztworu fenylohydrazyny w kwasie

siarkowym (62%).

Próby ogrzewa ć we wrz ą cej ła ź ni wodnej przez 30 minut. Dodatni odczyn jest

wówczas, gdy pojawia si ę Ŝ ółtobrunatne zabarwienie próby.

Chemiczne odró Ŝ nienie nieznacznych ró Ŝ nic w strukturze hormonów steroido-

wych jest ograniczone, szczególnie w płynach biologicznych, które zwykle s ą

mieszanin ą wielu steroidów. Hormony steroidowe C21, które zawieraj ą ugrupo-

wania 17

Reakcja Zimmermanna:

O H

N O 2

K O H

N O 2

O - K +

H 3 C

O - K +

N O 2

barwny kompleks

Wykonanie próby Zimmermanna:

Przygotowa ć dwie probówki zawieraj ą ce po:

– 0,5 ml etanolowego roztworu androsteronu (6x10 -4 %) – w pierwszej,

– 0,5 ml etanolu ( ś lepa) – w drugiej probówce.

· Do obu prób doda ć po 0,5 ml 1% etanolowego roztworu m-dinitrobenzenu,

wymiesza ć , po czym do obu doda ć po: 0,5 ml 8 M roztworu NaOH w celu za-

lkalizowania.

Dodatni odczyn jest wówczas, gdy pojawia si ę czerwone zabarwienie próby,

które pogł ę bia si ę w czasie przetrzymywania (do 20 min) prób w ciemno-

ś ci w temperaturze pokojowej.

Wykonanie próby Kobera:

Przygotowa ć dwie probówki zawieraj ą ce po:

– 0,5 ml 0,005% etanolowego roztworu estradiolu – w pierwszej,

– 0,5 ml etanolu ( ś lepa) – w drugiej probówce.

Do obu prób doda ć po 2 ml 4% roztworu hydrochinonu w st ęŜ onym kwasie

siarkowym, wymiesza ć i wstawi ć do wrz ą cej ła ź ni wodnej na 10 minut.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: