recesywne mutacje zwiazane z plcia u drosobhila.pdf

(376 KB) Pobierz
B
B.20. RECESYWNE MUTACJE LETALNE ZWIĄZANE Z PŁCIĄ U DROSOPHILA
MELANOGASTER
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie są stosowane.
1.4. Zasada metody badawczej
Badanie recesywnych mutacji letalnych związanych z płcią u Drosophila melanogaster (SLRL) wykrywa
występowanie mutacji zarówno punktowych, jak i małych delecji, w liniach komórek rozrodczych owadów.
Badanie jest testem na mutacje postępowe, który umożliwia wykrycie mutacji w ok. 800 loci na chromosomie X.
Odpowiada to ok. 80% wszystkich loci na chromosomie X. Chromosom X stanowi w przybliżeniu 1/5 całego
genomu haploidalnego.
Mutacje w chromosomie X u Drosophila melanogaster wyrażają się fenotypowo u samców posiadających
zmutowany gen. Kiedy mutacja jest letalna (w warunkach hemizygotycznych) o jej występowaniu świadczy
nieobecność jednej z dwóch klas samców potomnych, zwykle wydawanych przez heterozygotyczne samice.
Badanie SLRL opiera się na wykrywaniu obecności specjalnych markerów i zmienionych chromosomów.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie są stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
1.6.1.1. Zwierzęta
Do badań używa się samców typu dzikiego i samic rasy Muller-5. Można również stosować samice innych ras
z wielokrotnymi inwersjami chromosomu X.
1.6.1.2. Substancja badana
Badane substancje powinny być rozpuszczone w wodzie. Nierozpuszczalne w wodzie substancje mogą być
rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednim nośniku (np. w mieszaninie alkoholu etylowego i Tween 60 lub
80), a następnie przed podaniem rozcieńczone w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej. Nie powinno się
stosować dimetylosulfotlenku (DMSO) jako nośnika.
1.6.1.3. Liczba zwierząt
Badanie powinno być zaplanowane po wcześniejszym określeniu jego czułości i siły. Częstość występowania
mutantów spontanicznych obserwowana w odpowiedniej kontroli wpływa znacząco na liczbę chromosomów,
które muszą być poddane analizie.
1.6.1.4. Droga podania
Substancja może być podana doustnie, przez iniekcję lub przez ekspozycję na gazy lub pary. Karmienie badaną
substancją może odbywać się przez podanie jej w roztworze cukru. W razie konieczności substancje mogą być
rozpuszczane w 0,7% roztworze NaCl i wstrzyknięte do tułowia lub odwłoka.
1.6.1.5. Użycie kontroli dodatnich i ujemnych
218
 
Do badania powinno się włączyć kontrole dodatnią i ujemną (nośnik). Kontrole takie nie są konieczne, jeżeli
prowadzące badania laboratorium dysponuje archiwalnymi wynikami kontroli.
1.6.1.6. Poziomy dawkowania
Powinno się użyć 3 poziomów dawkowania. Do wstępnej oceny można zastosować jeden poziom ekspozycji na
badaną substancję w maksymalnym tolerowanym stężeniu lub w stężeniu wywołującym oznaki toksyczności.
W przypadku substancji nietoksycznych można użyć maksymalnej dawki możliwej do osiągnięcia.
1.6.2. Opis postępowania
Samce typu dzikiego (3-5 dniowe) są poddawane działaniu badanej substancji i indywidualnie kojarzone
z występującymi w nadmiarze dziewiczymi samicami rasy Muller-5 lub z samicami innej rasy z odpowiednimi
markerami (wielokrotnie odwróconymi chromosomami X). Samice są zastępowane nowymi samicami
dziewiczymi co dwa, trzy dni, aby wykorzystać komórki rozrodcze we wszystkich fazach cyklu rozwojowego.
U potomstwa tych samic zlicza się obecność efektów letalnych odpowiadających skutkom działania badanej
substancji na komórki rozrodcze samców w stadium dojrzałych plemników, pośrednich, późnych lub wczesnych
spermatyd, spermatocytów i spermatogoniów.
Samice heterozygotyczne F 1 z powyższych krzyżówek są przeznaczone do kojarzenia indywidualnie z braćmi (tj.
jedna samica w fiolce). W pokoleniu F 2 każda hodowla jest analizowana pod względem braku samców typu
dzikiego. Jeśli okazuje się, że hodowla powstała z samic F 1 przenoszących rodzicielski letalny chromosom X
(tzn. nie obserwuje się samców z omawianym chromosomem), powinno się sprawdzić, czy letalność pojawi się u
potomstwa córki tej samicy z takim samym genotypem.
2. WYNIKI
Wyniki powinny być zamieszczone w formie tabel i obejmować liczbę przebadanych chromosomów, liczbę
niepłodnych samców oraz liczbę letalnych chromosomów dla każdego zastosowanego stężenia i każdego okresu
kojarzenia eksponowanego samca. Powinno się przedstawić liczby rojów różnych wielkości w przeliczeniu na
samca. Wyniki te powinny być potwierdzone w oddzielnym eksperymencie.
Przyjmuje się możliwość użycia różnych metod statystycznych przy ocenie wyników badań recesywnych mutacji
letalnych związanych z płcią. Powinno się rozważyć i ocenić przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej
mutacje recesywne pochodzące od jednego samca.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- rasę: stosowana rasa lub szczep Drosophila , wiek owadów, liczba eksponowanych samców, liczba samców
niepłodnych, liczba ustalonych hodowli F 2 , liczba hodowli F 2 bez potomstwa, liczba chromosomów
przenoszących mutację letalną wykrywaną w każdym stadium komórek rozrodczych,
- kryteria doboru wielkości grup narażanych,
- warunki doświadczalne: szczegółowy opis sposobu ekspozycji i pobrania materiału do badań, dawki, dane
na temat toksyczności, kontrole dodatnie i ujemne, jeśli je używano,
- kryteria zliczania mutacji letalnych,
- zależność dawka/odpowiedź, jeżeli istnieje,
- ocenę statystyczną,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
219
 
B.21. TRANSFORMACJA KOMÓREK SSAKÓW IN VITRO
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie są stosowane.
1.4. Zasada metody badawczej
W celu wykrycia zmian fenotypowych w komórkach wywoływanych przez związki chemiczne indukujące
złośliwą transormację in vivo , można użyć komórek ssaków hodowanych in vitro . W testach opartych na
wykrywaniu zmian w morfologii komórek, tworzeniu skupisk lub zdolnościach do zakotwiczania w półpłynnym
agarze najczęściej stosuje się komórki C3H10T 1/2 , 3T3, SHE, komórki szczurów rasy Fisher. Istnieją także
rzadziej używane metody, wykrywające innego rodzaju zmiany fizjologiczne lub morfologiczne w komórkach
eksponowanych na związki rakotwórcze. Żaden z parametrów ocenianych metodami in vitro nie odpowiada
w sposób bezpośredni mechanizmom powstawania nowotworów. Niektóre z tych metod mogą służyć do
wykrywania związków chemicznych o cechach promotorów. Cytotoksyczność danego związku może być
oznaczona poprzez określenie jego wpływu na zdolności komórek do tworzenia kolonii (zdolność klonowania)
lub na szybkość wzrostu kolonii. Pomiar cytotoksyczności służy potwierdzeniu, że ekspozycja na dany związek
jest uzasadniona pod względem toksykologicznym, ale nie może być użyta do obliczenia częstości transformacji
we wszystkich testach, ponieważ niektóre z nich mogą wymagać przedłużonej inkubacji i/lub przenoszenia na
nowe podłoża.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie są stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
1.6.1.1. Komórki
W zależności od używanego testu transformacji dostępne są różne rodzaje linii komórkowych lub komórek
pierwotnych. Badający musi się upewnić, że komórki testowane wykazują odpowiednie zmiany fenotypowe po
ekspozycji na znany związek rakotwórczy i że używany test w warunkach danego laboratorium posiada
udowodnioną ważność i niezawodność.
1.6.1.2. Podłoże hodowlane
Należy używać odpowiednich podłoży i warunków doświadczalnych do odpowiedniego testu transformacji.
1.6.1.3. Substancja badana
Badana substancja przed ekspozycją komórek może być przygotowana w medium hodowlanym lub rozpuszczona
bądź zawieszona w odpowiednim nośniku. Końcowe stężenie nośnika w hodowli nie powinno wpływać na
żywotność komórek, szybkość ich wzrostu lub występowanie transformacji.
1.6.1.4. Aktywacja metaboliczna
220
 
Komórki powinny być eksponowane na badaną substancję zarówno w obecności, jak i bez odpowiedniego
układu aktywacji metabolicznej. Jeżeli komórki posiadają własną aktywność metaboliczną, jej rodzaj powinien
być znany, aby ją odpowiednio dostosować do grupy chemicznej testowanego związku.
1.6.2. Warunki doświadczalne
1.6.2.1. Użycie kontroli dodatnich i ujemnych
Dla każdego eksperymentu wykonujemy dwie kontrole dodatnie: z użyciem substancji bezpośrednio aktywnej
i związku wymagającego aktywacji metabolicznej. Zastosowany nośnik powinien stanowić kontrolę ujemną.
Przykłady substancji, które mogą być użyte jako kontrola dodatnia:
1) Substancje bezpośrednio aktywne (mutageny bezpośrednie):
- etylometanosulfonian,
--propionolakton;
2) Substancje aktywne po zmetabolizowaniu (mutageny pośrednie):
- 2-acetyloaminofluoren,
- 4-dimetyloaminoazobenzen,
- 7,12-dimetylobenzantracen.
Dodatkowo jako substancja kontrolna dodatnia może być stosowana substancja z tej samej grupy chemicznej, jak
substancja użyta do testowania.
1.6.2.2. Stężenia stosowane w ekspozycji
Powinno się stosować kilka stężeń substancji badanej. Stężenia te powinny spowodować efekt toksyczny zależny
od dawki; najwyższe stężenie powinno wywołać efekt małej przeżywalności komórek, natomiast przeżywalność
komórek w niskim stężeniu powinna być zbliżona do wartości w kontroli ujemnej. Substancje słabo
rozpuszczalne w wodzie powinny być przetestowane w stężeniach, aż do granicy ich rozpuszczalności. Dla
wodnych roztworów substancji nietoksycznej, dobrze rozpuszczalnej, najwyższe stężenie powinno być określone
w zależności od potrzeb.
1.6.3. Opis postępowania
Komórki powinny być eksponowane przez wymagany okres czasu, w zależności od użytego układu
doświadczalnego, czemu może towarzyszyć ponawiana ekspozycja związana z wymianą podłoża (i, jeśli to
konieczne, z wymianą na świeży układ aktywacji metabolicznej), w przypadku jeżeli ekspozycja ta jest
wydłużona. Komórki bez wystarczającej własnej aktywności metabolicznej powinny być eksponowane na daną
substancję zarówno w obecności, jak i bez odpowiedniego układu aktywacji metabolicznej. Po ekspozycji
komórki należy przemyć, usuwając badaną substancję i kontynuować hodowlę w odpowiednich warunkach
mających na celu uwidocznienie zmienionego fenotypu. Następnie należy oznaczyć częstość transformacji.
Wszystkie wyniki muszą być potwierdzone w niezależnym eksperymencie.
2. WYNIKI
Wyniki należy przedstawić w tabelach, które mogą przybrać różną formę w zależności od używanego testu, np.
tabele przedstawiające liczbę płytek, liczbę płytek z wynikami dodatnimi lub liczbę komórek po transformacji.
Jeżeli jest to możliwe, przeżywalność komórek powinna być wyrażona w postaci procentu wartości uzyskanej
w hodowli kontrolnej, a częstość transformacji w postaci liczby komórek po transformacji przypadających na
liczbę komórek żywych. Wyniki należy ocenić przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- rodzaj użytych komórek, liczbę hodowli komórkowych, metody utrzymywania hodowli,
- warunki doświadczalne: stężenie badanej substancji, użyty nośnik, czas inkubacji, długość i częstość
ekspozycji, gęstość komórek podczas ekspozycji, rodzaj zastosowanego, egzogennego układu aktywacji
metabolicznej, użyte kontrole dodatnie i ujemne, wyszczególnienie monitorowanego fenotypu, układ
selektywny (jeśli używano), uzasadnienie wyboru dawek,
- metodę zliczania komórek żywych i po transformacji,
221
 
- ocenę statystyczną,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
222
 

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin