14_Chromatografia_Cienkowarstwowa.pdf
(
37 KB
)
Pobierz
014
14.
CHROMATOGRAFIA
CIENKOWARSTWOWA
1. Chromatografia cienkowarstwowa aminokwasów
Zasada:
Technik
ę
chromatografii cienkowarstwowej wyró
Ŝ
nia kształt i rodzaj fazy sta-
cjonarnej, uformowanej w postaci cienkiej warstwy nało
Ŝ
onej na płaskie podło-
Ŝ
e, zapewniaj
ą
ce dostateczn
ą
wytrzymało
ść
mechaniczn
ą
. Płaskim podło
Ŝ
em
zwykle s
ą
płytki szklane, płytki z folii aluminiowej lub plastykowej. Cienk
ą
warstw
ę
zło
Ŝ
a mog
ą
stanowi
ć
:
Ŝ
el krzemionkowy (Kiselgel, silica gel), ziemia
okrzemkowa (Kiselgur, celit, diatomaceous earth), niezmodyfikowana lub zmo-
dyfikowana chemicznie celuloza, tlenek glinowy (Al
2
O
3
), podło
Ŝ
a jonowy-
mienne lub inne. Warstw
ę
wybranego zło
Ŝ
a mo
Ŝ
na nało
Ŝ
y
ć
na płytki samo-
dzielnie, wykorzystuj
ą
c do nakładania zawiesiny specjalny przyrz
ą
d zwany po-
wlekaczem. Przygotowywane samodzielnie płytki nale
Ŝ
y zaktywowa
ć
przed na-
ło
Ŝ
eniem prób. W tym celu umieszcza si
ę
płytki w suszarce o temperaturze
120
0
C na 10 minut. Mo
Ŝ
na korzysta
ć
te
Ŝ
z gotowych płytek powleczonych
okre
ś
lonym zło
Ŝ
em, które s
ą
dost
ę
pne w sprzeda
Ŝ
y. Technik
ę
chromatografii
cienkowarstwowej stosuje si
ę
do rozdziału niemal wszystkich grup zwi
ą
zków
wa
Ŝ
nych biologicznie. Zazwyczaj rozdział zachodzi na zasadzie odwracalnej
adsorpcji na powierzchni fazy stałej (chromatografia adsorpcyjna) lub podziału
substancji mi
ę
dzy dwie fazy ciekłe (chromatografia podziałowa).
Wykonanie:
·
Na gotowej płytce zaznaczy
ć
delikatnie ołówkiem lini
ę
startu w odległo
ś
ci
1,5 cm od brzegu płytki. Na wykre
ś
lonej linii startu zaznaczy
ć
12 punktów
w odst
ę
pach 1,5 cm, rozpoczynaj
ą
c w odległo
ś
ci 1,5 cm od brzegu płytki.
W punktach tych zostan
ą
naniesionie kolejne roztwory aminokwasów wzor-
cowych (0,5%) oraz mieszaniny nr 1–3, zawieraj
ą
ce aminokwasy przezna-
czone do identyfikacji. Na górnym brzegu płytki, przeciwległym do punktów
zaznaczonych na linii startu, nale
Ŝ
y zapisa
ć
nazwy lub numery nanoszonych
wzorcowych aminokwasów i nieznanych mieszanin.
1
Nanoszenie prób wzorcowych i badanych
Za pomoc
ą
kapilary nanosimy w zaznaczonych punktach wzorce aminokwasów
w kolejno
ś
ci zapisanej na górnym brzegu płytki. Nanoszenie wykonujemy
przez delikatne dotkni
ę
cie ko
ń
ca kapilary do podło
Ŝ
a płytki, tak aby
ś
rednica
powstałej plamki roztworu na płytce nie była wi
ę
ksza ni
Ŝ
3 mm. Podczas nano-
szenia prób plamki suszymy strumieniem ciepłego powietrza z suszarki.
Rozwijanie chromatogramu
Chromatogramy cienkowarstwowe rozwija si
ę
w specjalnie przystosowanych
komorach chromatograficznych ze szlifowan
ą
szczeln
ą
pokryw
ą
. Przed u
Ŝ
y-
ciem wewn
ę
trzne dwie wi
ę
ksze
ś
ciany komory wyło
Ŝ
y
ć
bibuł
ą
filtracyjn
ą
. Do
komory nale
Ŝ
y wla
ć
ok. 120 ml mieszaniny rozpuszczalników słu
Ŝą
cych do
rozwijania chromatogramu, składaj
ą
cej si
ę
z n-butanolu, kwasu octowego, wo-
dy w stosunku obj
ę
to
ś
ciowym 4:1:1, przynajmniej na 25 minut przed wstawie-
niem płytek. Roztwór rozpuszczalników rozwijaj
ą
cych chromatogram wlewa
ć
tak, aby bibuła była dokładnie nas
ą
czona i na dnie komory została warstwa roz-
tworu. Takie przygotowanie komory chromatograficznej zapewnia maksymalne
wysycenie wn
ę
trza komory chromatograficznej parami rozpuszczalników. Płyt-
k
ę
chromatograficzn
ą
z naniesionymi próbami chwyci
ć
za górn
ą
kraw
ę
d
ź
(uni-
kaj
ą
c dotykania palcami dolnej cz
ęś
ci płytki). Wstawi
ć
płytk
ę
pionowo do ko-
mory chromatograficznej (kraw
ę
d
ź
płytki z lini
ą
startu ma by
ć
zwrócona ku do-
łowi), ostro
Ŝ
nie wsuwaj
ą
c mi
ę
dzy równoległe rowki przeciwległych
ś
cian ko-
mory. Kraw
ę
dzie boczne płytki nie mog
ą
dotyka
ć
bibuły, poniewa
Ŝ
mo
Ŝ
e to
spowodowa
ć
nierównomierne wznoszenie si
ę
rozpuszczalnika. Rozwijanie
chromatogramu prowadzi
ć
przez 60 minut w szczelnie zamkni
ę
tej komorze. Po
tym czasie płytk
ę
wyj
ąć
z komory chromatograficznej i zaznaczy
ć
ołówkiem
front wzniesienia eluentu. Nast
ę
pnie płytk
ę
wysuszy
ć
pod dygestorium, w
strumieniu ciepłego powietrza z termowentylatora.
Wywołanie chromatogramu
Wysuszon
ą
płytk
ę
, po ustawieniu pionowo pod dygestorium, spryska
ć
z rozpy-
lacza roztworem 0,3% kwa
ś
nej ninhydryny w butanolu, tak aby rozpylany roz-
twór nie spływał po płytce. Płytk
ę
ogrzewa
ć
strumieniem gor
ą
cego powietrza
a
Ŝ
do pojawienia si
ę
zabarwionych plamek aminokwasów.
Interpretacja chromatogramu
Uwidocznione plamki obrysowa
ć
ołówkiem, wyznaczy
ć
ś
rodek plamki i zmie-
rzy
ć
odległo
ść
od miejsca startu do
ś
rodka plamki, czyli drog
ę
przebyt
ą
przez
2
ka
Ŝ
dy aminokwas. Zmierzy
ć
drog
ę
przebyt
ą
przez rozpuszczalnik. Obliczy
ć
warto
ś
ci współczynników R
f
dla wszystkich wzorcowych aminokwasów i skład-
ników mieszanin nieznanych aminokwasów. Na podstawie warto
ś
ci R
f
zidenty-
fikowa
ć
skład rozdzielonych mieszanin aminokwasów.
2. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów osocza
Zasada:
Chromatografia cienkowarstwowa, ze wzgl
ę
du na łatwo
ść
wykonania, mini-
malne potrzeby aparaturowe i niski koszt, mo
Ŝ
e by
ć
metod
ą
z wyboru do roz-
działu lipidów osocza. Ekstrakt chloroformowy lipidów osocza (patrz
ć
wiczenie
8) mo
Ŝ
na rozdzieli
ć
wst
ę
puj
ą
c
ą
technik
ą
chromatografii cienkowarstwowej na
Ŝ
elu krzemionkowym, stosuj
ą
c układ rozpuszczalników: eter naftowy, st
ęŜ
ony
kwas octowy, eter etylowy w stosunku obj
ę
to
ś
ciowym 39:1:10. Technika ta po-
zwala rozdzieli
ć
i uwidoczni
ć
na chromatogramie frakcj
ę
estrów cholesterolu,
triacylogliceroli, wolnych kwasów tłuszczowych, cholesterolu i fosfolipidów.
Wykonanie:
·
Ć
wiczenie nale
Ŝ
y wykona
ć
w ten sam sposób, jak
ć
wiczenie 1, w którym opi-
sano szczegółowo poszczególne etapy procedury.
·
Nanoszenie prób badanych i wzorcowych.
Po przygotowaniu płytek, jak
opisano wcze
ś
niej, na starcie w dwóch miejscach nało
Ŝ
y
ć
kapilar
ą
chloro-
formowy ekstrakt lipidów. Jako próby wzorcowe nanie
ść
2% chloroformowy
roztwór cholesterolu, roztwór fosfolipidów i roztwór triacylogliceroli.
·
Rozwijanie chromatogramu technik
ą
wst
ę
puj
ą
c
ą
.
Do komory chromato-
graficznej wla
ć
120 ml eluentu o składzie eter naftowy, st
ęŜ
ony kwas octowy,
eter etylowy w stosunku obj
ę
to
ś
ciowym 39:1:10. Płytki z nało
Ŝ
onymi próba-
mi wstawi
ć
do komory na 60 minut, jak opisano poprzednio, w celu rozwi-
ni
ę
cia chromatogramu. Po tym czasie płytk
ę
wyj
ąć
z komory chromatogra-
ficznej i zaznaczy
ć
ołówkiem front wzniesienia eluentu. Nast
ę
pnie płytk
ę
wysuszy
ć
pod dygestorium w strumieniu ciepłego powietrza z termowentyla-
tora.
·
Wywołanie chromatogramu.
Wysuszon
ą
płytk
ę
wstawi
ć
na kilka minut do
komory z J
2
w celu wybarwienia rozdzielonych frakcji lipidów. Pojawiaj
ą
ce
si
ę
Ŝ
ółtobrunatne zabarwienie wynika z wysycenia jodem podwójnych wi
ą
-
za
ń
rozdzielanych zwi
ą
zków. Alternatywnie, drug
ą
płytk
ę
spryska
ć
odczyn-
nikiem utleniaj
ą
cym (0,6% dwuchromian potasowy w 50% kwasie siarko-
wym).
3
·
Interpretacja chromatogramu.
Obliczy
ć
warto
ś
ci współczynników R
f
dla
wszystkich wzorcowych substancji oraz poszczególnych składników rozdzie-
lanego ekstraktu lipidów, które nale
Ŝ
y zidentyfikowa
ć
.
ODCZYNNIKI
Płytki pokryte
Ŝ
elem krzemionkowym; 0,2% roztwory aminokwasów wzorco-
wych: cystyna, arginina (Arg), glutamina (Gln), asparagina (Asn), treonina
(Thr), leucyna (Leu), tyrozyna (Tyr), tryptofan (Trp), prolina (Pro); mieszaniny
aminokwasów do identyfikacji: 1, 2, 3; roztwór elucyjny 1: n-butanol-kwas
octowy-woda (w stosunku obj
ę
to
ś
ciowym 4:1:1); 0,3% roztwór kwa
ś
nej nin-
hydryny w butanolu (0,3 g ninhydryny + 100 ml butanolu + 3 ml kwasu octo-
wego); ekstrakt chloroformowy lipidów z osocza (25 mg/ml); roztwór elucyjny
2: eter naftowy-st
ęŜ
ony kwas octowy-eter etylowy (w stosunku obj
ę
to
ś
ciowym
39:1:10); 2% roztwór chloroformowy cholesterolu; fosfolipidów; triacyloglice-
roli; J
2
, 0,6% dwuchromian potasu w 50% kwasie siarkowym.
NOTATKI
4
Plik z chomika:
pato_88
Inne pliki z tego folderu:
dodatki.pdf
(84 KB)
15_Elektroforeza_zelowa.pdf
(37 KB)
14_Chromatografia_Cienkowarstwowa.pdf
(37 KB)
13_Wlasnosci_i_sklad_kwasow_nukleinowych(1).pdf
(70 KB)
13_Wlasnosci_i_sklad_kwasow_nukleinowych.pdf
(70 KB)
Inne foldery tego chomika:
Anatomia
Antropologia
Badanie radiologiczne w ortopedii
Biomechanika
Farmakoterapia
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin