Ćwiczenia z mikrobiologii dla biotechnologów.pdf

Program Ć wicze Ń z mikrobiologii dla biotechnologów

(II rok)

Ć wiczenie 1

Metody sterylizacji szkła laboratoryjnego i po Ż ywek mikrobiologicznych.

Podło Ż a i po Ż ywki mikrobiologiczne.

Praca w warunkach jałowych.

Ć wiczenie 2

Formy morfologiczne bakterii.

Podział bakterii na gram ujemne i gram dodatnie. Barwienie komórek bakteryjnych.

Budowa komórki bakteryjnej.

Ć wiczenie 3

Wpływ czynników fizykochemicznych na bakterie.

Ć wiczenie 4

Metody hodowli bakterii – w podło Ż u płynnym, hodowla beztlenowców

Posiew na szereg biochemiczny- badanie wła Ś ciwo Ś ci biochemicznych wybranych

pałeczek jelitowych

Morfologia kolonii bakteryjnych na ró Ż nych podło Ż ach mikrobiologicznych.

Ć wiczenie 5

Oznaczanie wra Ż liwo Ś ci bakterii na chemioterapeutyki (antybiotyki, sulfonamidy, fitoncydy,

bakteriocyny)

Bakteriofagi- oznaczanie wra Ż liwo Ś ci bakterii na bakteriofagi, miano lizatu fagowego,

streak-test.

Ć wiczenie 6

Podstawowe odczyny serologiczne.

Baketrie z rodzajów Neisseriae i Corynebacterium

Ziarniaki A,B,G-hemolizuj Ą ce.

Ć wiczenie 7

Zaliczenie – kolokwium (wspólne dla wszystkich grup)

Ć wiczenie 1

Przygotowanie do pracy w laboratorium mikrobiologicznym

Zapoznanie studentów z instrukcj Ą BHP

I. Metody hodowli mikroorganizmów - rodzaje podło Ż y mikrobiologicznych

( DEMONSTRACJA ):

a) podło Ż a płynne i stałe

b) podło Ż e zwyczajne (LA - Luria agar), wybiórczo-ró Ż nicuj Ą ce (MacConkey’a,

Chpmana), wybiórcze (selektywne; Sabouroda).

II. Sterylizacja w autoklawie i aparacie Kocha

Mamy do dyspozycji sze ŚĆ probówek z jałowym bulionem.

probówki: 1, 2, 3 nale Ż y zaszczepi Ć hodowl ą nocn ą Escherichia coli (po 100Μl),

probówki: 4, 5, 6 zaszczepi Ć hodowl ą nocn ą Bacillus subtilis (po 100Μl).

a) probówki 1 i 4 jałowi Ć w autoklawie przez 30 min. w temp. 121 o C

b) probówki 2 i 5 jałowi Ć w aparacie Kocha przez 30 minut.

c) probówki 3 i 6 - nie jałowi Ć (kontrola).

Probówki inkubowa Ć w wytrz ą sarce w 37 o C przez 24 godziny, a nast Ę pnie schowa Ć do

lodówki. Wyniki do Ś wiadczenia b Ę d Ą omówione na nast Ę pnych Ć wiczeniach. Hodowle

wyj Ś ciowe badanych bakterii równie Ż zostan Ą przechowane do nast Ę pnych Ć wicze Ń w

celu wybarwienia przetrwalników i wykonania preparatów mikroskopowych.

III. Sterylizacja przez s Ą czenie (DEMONSTRACJA)

IV. Posiew bakterii na podło Ż e stałe:

a) posiew redukcyjny Escherichia coli - ka Ż dy student wykonuje posiew na podło Ż u

b) posiew w postaci murawy – ka Ż da para wysiewa na podło Ż e LA

- 0,1 ml hodowli E. coli

- 0,1 ml hodowli Bacillus subtilis (do wyboru bakterie po autoklawowaniu, po

gotowaniu w aparacie Kocha, hodowle kontrolne)

c) łapanie bakterii z powietrza ka Ż da para ma do dyspozycji 1 płytk Ę

d) posiew na skos E. coli .

e) posiew na słupek E. coli .

Ka Ż da para ma do dyspozycji 6 płytek LA

opaliĆ ezĘ

V. Obserwacja wzrostu mikroorganizmów , morfologia kolonii na podło Ż ach stałych i

płynnych

a) podło Ż e Chapmana - ( Staphylococcus, Micrococcus sp .)

b) podło Ż e McConkeya ( E. coli - lac + , Serratia marcescens ).

c) podło Ż e Sabourouda ( Candida sp., E. coli ).

d) Agar wzbogacony

Pałeczki

E.coli, Erwinia lej Ą ca si Ę , Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella anatum,

Klebsiella oxytoca, Flavobacterium okeanokoites, Enterobacter spp. Pseudomonas

opaliĆ ezĘ

Inkubacja w odpowiednich warunkach

Wzrost bakterii

opaliĆ ezĘ

Posiew redukcyjny

aeruginosa, Pseudomonas spp. Brunatny, Pseudomonas spp.( Fluoryzuj Ą cy ),

Xanthomonas,

Laseczki

Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus spp.

Ziarniaki

Micrococcus sp, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Gafkya tetragena, Sarcina spp.

Dro Ż dzaki

Candida sp. Candida albicans .

Bakterie dnia:

Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus,

Bacillus spp.

WIADOMO Ś CI TEORETYCZNE.

1. Mycie i sterylizacja szkła laboratoryjnego.

a) szkło nowe - posiada odczyn zasadowy - eliminacja przez zanurzenie w 1% HCl lub 15

minutowe gotowanie.

b) szkło u Ż ywane - 24h moczenie w chromiance (dwuchromian potasu, kwas siarkowy i

woda).

Sterylizacja - (łac. sterylis - jałowy) - proces zabicia drobnoustrojów (formy wegetatywne i

przetrwalnikowe).

Metody sterylizacji:

a) fizyczne - sterylizacja cieplna (sucha) lub z par Ą wodn Ą ,

sterylizacja UV,

sterylizacja promieniami jonizuj Ą cymi,

sterylizacja ultrad Ź wi Ę kami.

b) mechaniczne (filtracja),

c) chemiczne (dezynfekcja).

Ad a) Sterylizacja cieplna-sucha:

* wy Ż arzanie (ezy, igły, skalpele)

* opalanie (brzeg probówki, bagietki)

* suszenie (szkło laboratoryjne)

140oC - 2,5h, 170oC - 1,0h

Sterylizacja par Ą wodn Ą

* gotowanie (strzykawki, instrumenty chirurgiczne)

* autoklawowanie (po Ż ywki)

0,7 atm. - 117oC; 3,0 atm - 134oC

* jałowienie w aparacie Kocha (po Ż ywki do 100oC).

Pasteryzacja - stosowana w celu zniszczenia form wegetatywnych w płynnych Ś rodkach

spo Ż ywczych (np. w mleku) - jednorazowe podgrzanie do 60-80oC.

Tyndalizacja - pasteryzacja frakcjonowana. Niszczy formy wegetatywne i przetrwalnikowe

–

3-krotna pasteryzacja w odst Ę pach 24h.

Sterylizacja UV (długo ŚĆ fali 250nm) - uszkadza struktur Ę kwasów nukleinowych (DNA) -

stosowana do sterylizacji pomieszcze Ń , naczy Ń z tworzyw sztucznych i plastikowych.

Najmniej odporne s Ą zarodniki ple Ś ni.

Ultrad Ź wi Ę ki - fale d Ź wi Ę kowe powy Ż ej 20 tys. Hz - metoda oparta na zjawisku kawitacji.

Polega na rozrywaniu roztworu przez powstanie w nim p Ę cherzyków gazów, co prowadzi

do mechanicznego rozerwania komórek od wewn Ą trz. Metod Ą t Ą nie mo Ż na zabi Ć

przetrwalników.

Ad b) Filtracja (podło Ż a płynne np. surowica, roztwór mocznika, witaminy) - przy filtracji

cz Ę sto stosuje si Ę podci Ś nienie.

* filtry z ziemi okrzemkowej (Berkefelda),

* filtry z porcelany (Chamberlanda),

* filtry teflonowe

* filtry ze spiekanego szkła (schotta),

* filtry membranowe (molekularne) - z pergaminu, Ż elatyny, błon zwierz Ę cych

(zatrzymuj Ą wirusy).

Ad c) Dezynfekcja (chemiczna metoda sterylizacji) - jest to proces oczyszczania

powierzchni stołów, narz Ę dzi od drobnoustrojów zdolnych wywoła Ć zaka Ż enie (nie niszczy

form przetrwalnych).

Na sił Ę działania Ś rodków bakteriobójczych (dezynfekuj Ą cych) maj Ą wpływ nast Ę puj Ą ce

czynniki:

* rodzaj i wra Ż liwo ŚĆ drobnoustrojów,

* czas działania Ś rodka chemicznego,

* temperatura Ś rodowiska,

* st ĘŻ enie Ś rodka dezynfekuj Ą cego.

Ś rodki dezynfekuj Ą ce pomieszczenia i przedmioty:

* kwasy i zasady - 10% roztwory zasad, mleko wapienne - niszcz Ą przedmioty

* Ś rodki utleniaj Ą ce - po zetkni Ę ciu z komórkami drobnoustrojów wydzielaj Ą zjonizowany

tlen, w wyniku czego nast Ę puje uszkodzenie struktury błon cytoplazmatycznych (niszcz Ą

te Ż przetrwalniki - działaj Ą tak jak ozon). Podchloryny, chloraminy, jodyna (10% roztwór

jodu), 3% woda utleniona.

* sole metali ci ĘŻ kich (głównie srebra i rt Ę ci) - precypitacja i inaktywacja białek.

* organiczne zwi Ą zki dezynfekuj Ą ce:

- alkohole - denaturacja białek.

- fenole i krezole - trucizny protoplazmatyczne - wchodz Ą w reakcje ze Ś cian Ą komórkow Ą

(niszcz Ą formy wegetatywne bakterii i grzybów, na przetrwalniki oddziaływaj Ą słabo).

Przykłady: fenol, lizol, formaldehyd.

* detergenty - czwartorz Ę dowe zwi Ą zki amoniowe (posiadaj Ą du ŻĄ aktywno ŚĆ

powierzchniow Ą ) - ł Ą czy si Ę je z chlorowcami. Uszkadzaj Ą błony komórkowe, ale nie

niszcz Ą spor. Przykłady: Zephirol, Desogen, Sterinol.

Ś rodki dezynfekuj Ą ce powietrze - gazy, para, aerozole - glikol propylenowy, trietylenoglikol,

podchloryn sodu, sterinol, kwas mlekowy.

Sił Ę działania zwi Ą zku dezynfekcyjnego okre Ś la si Ę przez porównanie jego działania do

działania fenolu - tzw. współczynnik fenolowy (stosunek najwi Ę kszego rozcie Ń czenia

badanego zwi Ą zku zabijaj Ą cego mikroorganizmy w ci Ą gu 10 min. do najwi Ę kszego

rozcie Ń czenia fenolu zabijaj Ą cego mikroorganizmy w 10 min.

2. Po Ż ywki i podło Ż a mikrobiologiczne.

Po Ż ywki (podło Ż a) - płynne lub zestalone mieszaniny zło Ż one z odpowiednio dobranych

składników, słu ŻĄ cych hodowli drobnoustrojów in vitro (w szkle).

Po Ż ywki musz Ą :

a) zawiera Ć zwi Ą zki od Ż ywcze (pierwiastki biogenne C,N,O,H,S,P). Jako Ź ródła w Ę gla,

azotu, aminokwasów i witamin stosuje si Ę pepton. Jest to produkt enzymatycznej

hydrolizy białek za pomoc Ą pepsyny i HCl. Jest to mieszanina proteaz, polipeptydów i

aminokwasów.

b) mie Ć odpowiednie pH (z reguły 7,2-7,4).

c) by Ć jałowe,

d) oby Ć izotoniczne (podobne ci Ś nienie jak w komórkach drobnoustrojów, zwykle uzyskuje

si Ę przez dodanie soli NaCl). Podło Ż e hipotoniczne (o ni Ż szym ci Ś nieniu osmotycznym,

ni Ż w komórkach) powoduje p Ę cznienie komórek, a nawet ich p Ę kanie. W podło Ż u

hipertonicznym (o wy Ż szym ci Ś nieniu osmotycznym, ni Ż w komórkach) nast Ę puje

kurczenie si Ę plazmy komórkowej i oddzielanie od Ś ciany komórkowej (plazmoliza).

e) by Ć jednorodne.

Podział po Ż ywek ze wzgl Ę du na charakter składników:

* naturalne (wyci Ą g z krwi, z tkanek ro Ś linnych i zwierz Ę cych, mleko),

* syntetyczne (mieszanina substancji organicznych i nieorganicznych),

* półsyntetyczne (mieszane).

Podział po Ż ywek ze wzgl Ę du na wymagania od Ż ywcze drobnoustrojów:

* proste - bulion od Ż ywczy, agar od Ż ywczy.

* zło Ż one - jak wy Ż ej plus witaminy, substancje wzrostowe itp. W Ś ród nich wyró Ż nia si Ę :

- podło Ż a selektywne (wybiórcze) - które zawieraj Ą 1 lub 2 składniki hamuj Ą ce rozwój

drobnoustrojów, które chcemy wyeliminowa Ć z hodowli.

- podło Ż a ró Ż nicuj Ą ce (identyfikacyjne) - zawieraj Ą charakterystyczn Ą substancje, która jest

enzymatycznie rozkładana wył Ą cznie przez okre Ś lone gatunki drobnoustrojów.

Autotrofy - nie wymagaj Ą do wzrostu zwi Ą zków organicznych.

Prototrofy - wymagaj Ą do wzrostu 1 zwi Ą zku organicznego (rosn Ą na ubogich po Ż ywkach).

Heterotrofy - wymagaj Ą do wzrostu obecno Ś ci w po Ż ywce zwi Ą zków organicznych: (cukry -

Ź ródło w Ę gla), (aminokwasy - ŻĄ dło azotu), witamin i innych.

Auksotrofy - to heterotrofy, które potrzebuj Ą poza jednym stosunkowo prostym zwi Ą zkiem

organicznym, jeszcze co najmniej jednego zwi Ą zku organicznego, jak np. aminokwasy lub

witaminy.

Hypotrofy - bezwzgl Ę dne paso Ż yty - bytuj Ą w organizmie gospodarza.

Podział po Ż ywek ze wzgl Ę du na konsystencj Ę :

- płynne (bulion, podło Ż e mineralne, brzeczka).

- stałe (zestalone) - agar, podło Ż e Ż elatynowe.

- półpłynne - zawieraj Ą 0,15-0,2% agaru.

Agar - wielocukier zawieraj Ą cy galaktoz Ę , reszt Ę siarczanow Ą , jony Ca+2 i Mg+2

(uzyskuje si Ę go z krasnorostów). Rozpuszczalny w wodzie w temperaturze 95 - 99oC,

krzepnie za Ś w temperaturze 45 - 49oC. Tylko nieliczne bakterie morskie i glebowe go

rozkładaj Ą . W Ś rodowisku kwa Ś nym ulega hydrolizie i traci zdolno ŚĆ do tworzenia Ż elu.

Ż elatyna - białko proste otrzymywane z chrz Ą stek. Rozpuszcza si Ę w ciepłej wodzie, a w

temperaturze 25oC tworzy galaretowaty Ż el. Jest upłynniana i rozkładana przez bakterie i

grzyby wytwarzaj Ą ce enzymy proteolityczne (hydrolizuj Ą ce białko). Nie nadaje si Ę do

hodowli drobnoustrojów, ale ma zastosowanie do badania proteolitycznych wła Ś ciwo Ś ci

drobnoustrojów.

Podło Ż e McConkey - zawiera sole Ż ółci, które hamuj Ą rozwój wi Ę kszo Ś ci bakterii. Na

bazie tego podło Ż a przygotowuje si Ę po Ż ywk Ę wybiórcz Ą i ró Ż nicuj Ą c Ą .

*wybiórcza - dezoksycholan sodu pozwala na rozwój pałeczek z rodzaju Enterobacteriae

( Ż yj Ą ce w przewodzie pokarmowym człowieka) i Enterocoki.

*ró Ż nicuj Ą ca - zawiera laktoz Ę i wska Ź nik barwny - czerwie Ń oboj Ę tn Ą . Bakterie lac+

(rozkładaj Ą laktoz Ę - zmiana zabarwienia po Ż ywki na kolor fioletowy), bakterie lac- (bez

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: