WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.pdf

WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html

WEKTOR PO ŁACIIE ZACZY PRZEWOŹIK.

WEKTOR cząsteczka DNA mogąca być nośnikiem interesującego nas kawałka

DNA , która posiada zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek.

Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie a czasami

także wydajną synt ezę kodowanego przez gen białka (transkrypcję i translację oraz

jego stabilność) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. Są różne typy

wektorów a dobranie odpowiedniego zależy m.in. od tego w jakich komórkach

zamierzamy klonować gen. Najważniejszym elementem warunkującym specyficzność

wektora są sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji tzw. sekwencje ori.

Najprostsze wektory posiadały wyłącznie jedno , unikalne miejsce restrykcyjne , w

które można było wprowa dzić obcy DNA. Obecnie najczęściej jest to tzw. polilinker

syntetyczny odcinek DNA , w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc

rozpoznawanych

przez

różne

restryktazy.

Pozwala to na swobodniejszy dobór odpowiedniego do klonowania enzymu. Wektory

zazwyczaj posiadają również geny markerowe czyli geny kodujące białka

odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor mus i być tak

skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek , do których wniknął.

Jego budowa powinna pozwalać także na odróżnienie wektora zrekombinowanego od

takiego , który zamknął się bez ligacji z fragmentem DNA.

WEKTORY PLAZMIDOWE BAKTERYJE.

Budowa nieduże , koliste cząsteczki DNA zawierające ori replikacji , gen markera

selekcyjnego (najczęściej oporność na antybiotyk) oraz miejsce do klonowania.

Wektory plazmidowe wprowadzane są do

komórek bakterii przy wykorzystaniu

zjawiska transformacji. W przypadku

stosowanej najczęściej bakterii E.coli

wymaga to zwiększenia przepuszczalności

błon komórkowych czyli

ukompetentnienia. W tym c elu wystawia

się komórki na wysoką koncentrację

pewnych dwuwartościowych kationów. W

typowej procedurze komórki traktuje się

1 z 10

20100404 13:31

WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html

roztworem chlorku wapnia. Zazwyczaj 1

komórka na milion zostaje stransformowana. 1 cząsteczka na tysiąc

zrekombinowanych plazmidów transformuje komórkę bakteryjną. Każda

kompetentna komórka inkorporuje tylko jeden plazmid. Selekcję zazwyczaj uzyskuje

się na dwa sposoby. Pierwszy z nich to obecność w plazmidzie dwóch genów

oporności na dwa różne antybiotyki przy czym w j ednym z nich znajduje się miejsce

do klonowania. Komórka , która nie pobrała plazmidu będzie wrażliwa na obydwa

antybiotyki , taka , która pobrała plazmid niezrekombinowany będzie oporna na

obydwa. Komórka , która ma plazmid z fragmentem obcego DNA będzie wrażliwa na

antybiotyk , w którego genie było miejsce restrykcyjne , ponieważ ciągłość genu

zostanie przerwana co unieczynni produkowane białko. Drugi sposób to system

selekcji opierający się na tzw. teście alfakomplementacji. Polilinkery większości wek

torów umiejscowione są w obrębie genu kodującego a peptyd bgalaktozydazy.

Transformowane są bakterie , które mają mutację akurat we fragmencie genu

kodującym tą część enzymu. Umożliwia to selekcję na odpowiedniej pożywce bakterii

, które pobrały zrekombi nowany plazmid ponieważ tylko one będą białe w

odróżnieniu od tych , w których zaszła komplementacja mutacji i sprawny enzym

rozkłada substrat dodany w pożywce co powoduje niebieskie zabarwienie kolonii.

Pojedyncze komórki bakteryjne , utworzą kolonie a wszystkie plazmidy w takiej

kolonii będą pochodziły od jednego plazmidu wprowadzonego do komórki , która tą

kolonię założyła. Powstanie więc klon a fragment DNA na plazmidzie to sklonowany

DNA.

2 z 10

20100404 13:31

WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html

Pojemność wektorów plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania

rekombinacyjnych cząstek DNA do komórek gospodarza. Przy klasycznej

transformacji wielkość wstawki nie powinna być większa niż około 10 kb.

Warto zwrócić jeszcze uwagę na ilość kopii wektora w komórce. Istnieją wektory

niskokopijne i wysokokopijne co uzależnione jest od rodzaju ori.

3 z 10

20100404 13:31

WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html

Klonowanie w wektorze plazmidowym polega na przecięciu go stosownym enzymem

restrykcyjnym , defosforylacji jego końców w celu wyeliminowania możliwości

recyrkularyzacji samego wektora oraz ligacji , którą to reakcję przeprowadza ligaza

DNA tworz ąca standardowe wiązanie fosfodiestrowe , z odpowiednio wcześniej

przygotowanymi fragmentami DNA , które chcemy sklonować , pociętymi tą samą

restryktazą lub dającą komplementarne końce.

WEKTORY POCHODE BAKTERIOFAGÓW :

LAMBDOWE pochodne faga l.

Można w nich klonować większe fragmenty DNA. Inną zaletą jest wyższa wydajność

infekcji cząstkami bakteriofagów w porównaniu do wydajności transformacji.

Budowa

4 z 10

20100404 13:31

WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html

odpowiednio

zmodyfikowany bakt

eriofag

Wprowadzono

mutacje punktowe w

niektórych genach zmieniające właściwości ich produktów : krótkie delecje oraz

niekiedy usunięcie środkowego regionu DNA odpowiedzialnego za cykl lizogenny. Z

DNA faga można usunąć około 30% genomu pozostawiając j ego lewe i prawe ramię

zawierające wszystkie geny niezbędne w cyklu litycznym. Dzięki 12 nukleotydowym

, wzajemnie komplementarnym , jednoniciowym fragmentom DNA na końcach

cząsteczki DNA faga tzw. sekwencjom cos możliwe jest przybranie przez D NA

faga w komórce bakteryjnej formy kolistej oraz zapakowanie go w białkową główkę.

Również w te wektory wstawione są polilinkery , geny markerowe , silne promotory i

inne.

Są dwa rodzaje wektorów lambdowych , co spowodowane jest faktem , że do

białkowej główki pakowane jest DNA długości 75% do 105% długości DNA faga

typu dzikiego :

replacement tak skonstruowane , że centralny region jest oflankowany

identycznym zestawem miejsc restrykcyjnych tak , że przecięcie daną

restryktazą wycina ten region z wektora. Na jego miejsce może być wstawiony

obcy DNA długości 925 kb. Klonow anie polega na izolacji poszczególnych

ramion po wycięciu regionu centralnego i ligacji ze zdefosforylowanymi

fragmentami obcego DNA (co uniemożliwia wstawienie dwóch różnych

odcinków DNA do jednego wektora) w warunkach sprzyjających tworzeniu

konkata merów , następnie pakowaniu in vitro w kapsydy faga i infekcji

komórek E.coli.

5 z 10

20100404 13:31

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: