zespół Treacher Collins.pdf

I Konferencja U ytkowników

DNA Pointer System

Analiza zró nicowania genetycznego

metod MSSCP

Warszawa 15.05.2003

I Konferencja U ytkowników DNA Pointer System

Spis tre ci

1. Wst p 2

2. Program Konferencji 3

3. Streszczenia wyst pie Uczestników Konferencji 4

3.1. A.Mostowska, W. H Trzeciak 4

3.2. B.Marszałek, W. H Trzeciak 5

3.3. H.Berbe , A.D browski, M. Dmoszy!ska-Graniczka, A. Semczuk, A.Szczygielska 6

3.4. H.Fojcik, D.Moczulski, B.Gawlik, W.Grzeszczak 7

3.5. E.Borkowska , Constantinou M, Binka-Kowalska A, Kału0ewski B 8

3.6. R.Gierczy!ski, M. Jagielski, W. Rastawicki 10

4. Podsumowanie dyskusji pt. „Metodyka genotypowania MSSCP” 12

4.1. Sposób pobrania i transportu materiału biologicznego do laboratorium 12

4.2. Metody izolacji DNA/RNA 12

4.3. Przechowywanie wyizolowanego materiału genetycznego 13

4.4. Amplifikacji DNA metoda PCR 13

4.5. Przygotowanie 0eli do analizy MSSCP i SSCP 14

4.6. Denaturacja produktów PCR w celu uzyskania jednonicowych konformerów DNA 15

4.7. Warunki elektroforezy MSSCP

4.9. Barwienie DNA/RNA w 0elach poliakrylamidowych metod Silver Stain

4.10. Suszenie 0eli poliakrylamidowych

4.11. Cyfrowa archiwizacja obrazów 0eli

4.12. Interpretacja wyników rozdziału MSSCP/ SSCP

5. Metoda MSSCP – wprowadzenie

6. Lista aplikacji DNA Pointer System oraz metody MSSCP

7. Oferta DNA Pointer System v 4.0 i strategia PMES

8. Oferta rabatowa odczynników do genotypowania dla Uczestników Konferencji

9. Oferta BGM do elektroelucji fragmentów DNA/RNA

10. Oferta w pełni cyfrowej analizy obrazu

11. Wzór Karty Elektroforezy MSSCP

4.8. Optymalizacja warunków analizy zmienno>ci genetycznej metod MSSCP

I Konferencja U ytkowników DNA Pointer System

WST P

I Konferencja U0ytkowników DNA Pointer System odbyła siE w Warszawie w dniu 15 maja 2003

r. W pierwszej czE>ci Konferencji szereg zespołów zaprezentowało swoje wyniki z zakresu genomiki

funkcjonalnej oraz genetyki a w drugiej czE>ci spotkania odbyła siE dyskusja nt metodologii

genotypowania. metod MSSCP.

Mamy nadziejE, ze spotkanie to przyczyniło siE wymiany informacji na temat warunków i zasad

wykorzystania DNA Pointer System, a jednocze>nie stworzy forum wymiany informacji na tematy

takie jak:

•

metodologia genotypowania

•

sposobów rozwi zania problemów laboratoryjnych zwi zanych z genotypowaniem

•

praktycznych zastosowa! wyników bada! z zakresu analizy zmienno>ci genetycznej

W chwili obecnej dostEpne jest bardzo szerokie spektrum metod przeznaczonych do analizy

zmienno>ci genetycznej. Umo0liwia to optymalny dobór strategii i metodologii laboratoryjnej

dostosowanej do okre>lonego projektu badawczego. Poni0ej, na przykładzie analizy zmienno>ci w

genomie człowieka w celu wskazania celów (białek) dla działania nowych leków, chcieliby>my

przedstawi wymagaj jakie stwarzaj podobne eksperymenty.. Kluczowym krokiem planowania

takiego eksperymentu jest okre>lenie liczby prób któr nale0y przeanalizowa aby móc wyci gn

statystycznie znamienne wnioski. Przyjmijmy, 0e dla potrzeb skorelowania podło0a genetycznego

człowieka z okre>lon cech – fenotypem, minimalna liczba osób w grupie badanej i kontrolnej to od

60 do 200 osób. Szacuje siE 0e liczba polimorfizmów w genomie człowieka, które nale0y oznacza , by

znaleI korelacjE z dowolnym fenotypem dla du0ych mieszanych populacji wynosi 30-500 000.

Przyjmuj c 0e koszt oznaczenia sekwencji jednej pary zasad wynosi 10 zł i trwa 10 s aby wykona

powy0sze zadanie potrzebowaliby>my od 18 mln do 1 mld zl a czas niezbEdny na ta prace to od 96 do

384 lat. W tej sytuacji nawet najwiEksze firmy farmaceutyczne nie s w stanie samodzielnie rozwi za

tych problemów. Te ograniczenia, przyczyniły siE czE>ciowo do utworzeniu w 1999 roku The SNP

Consortium które dotychczas opublikowało ponad 1,8 mln SNP w genomie człowieka. Dane te oraz

opublikowanie sekwencji genomu człowieka stworzyły podstawy do podjEcia takich bada! przez

pierwsze firmy (np. DeCode Genetics . Reykjavik).

Wydaje siE, 0e w chwili obecnej polskie zespoły naukowo-badawcze (finansowane z bud0etu

pa!stwa), jako najbardziej realn drog poznania korelacji pomiEdzy genotypem a fenotypem mog

podejmowa próby okre>lania tej korelacji w obrEbie arbitralnie wybranych rejonów genomu. Bior c

pod uwagE fakt, 0e populacja Polski jest zdecydowanie bardziej heterogenna ani0eli populacja np.

Islandii, aby minimalizowa ryzyko błEdu, badania takie nale0y wykona na ponad 100 osobowej

grupie osób badanych i 100 osobowej grupie kontrolnej.

Ze wzglEdu na powy0sze ograniczenia czasowe i finansowe, powszechne jest stosowanie dwu

etapowej strategii analizy zmienno>ci genetycznej. W pierwszym przesiewowym etapie stosuje siE

po>rednie metody wykrywania SNP i mutacji np.SSCP lub MSSCP, DGGE, - a w drugim w celu

potwierdzenia zaobserwowanego genotypu wykorzystanie metody specyficznej np. RFLP lub

hybrydyzacja. Wybrane próby podaje siE sekwencjonowaniu. Taka kilku etapowa, po>rednia strategia

analizy zmienno>ci genetycznej umo0liwia w relatywnie krótkim czasie przy minimalnych kosztach

uzyskanie statystycznie znamiennych wyników a jednocze>nie jest skuteczna drog odkrywania

nowych mutacji i polimorfizmów.

Dla powodzenia takich projektów niezwykle wa0ne jest dobór odpowiednich metod i narzEdzi

na poszczególnych etapach analizy genetycznej. Najszybsze i najta!sze w eksploatacji metody analizy

DNA/RNA pozwalaj wyselekcjonowa próby których genotyp zostanie okre>lony na dalszych

etapach. Bez w tpienia do tych metod nale0y metoda wielotemparturowego SSCP (MSSCP) która w

całej pełni wykorzystuje swoje mo0liwo>ci przy wykorzystaniu DNA Pointer System.

I Konferencja U ytkowników DNA Pointer System

PROGRAM KONFERENCJI

10.00 Rozpocz cie Konferencji

10:10 Prezentacje u ytkowników DNA Pointer System:

Mostowska, Adrianna, Wiesław H. Trzeciak, Akademia Medyczna, Pozna)

„Analiza molekularna genów PAX9 i MSX1 u chorych z wrodzonym

brakiem zawi zków z bów stałych”

Marszałek,Wiesław, Bo ena,.Wiesław H.Trzeciak, Akademia Medyczna,

Pozna)

„Podło#e molekularne zespołu Treacher Collins”,

Sławomir A. Wi niewski, Wiesław H. Trzeciak, Akademia Medyczna, Pozna)

„Rola )cie#ki sygnałowej EDA-EDAR/XEDAR w ró#nicowaniu przydatków skóry”

Henryk Berbe , A. D+browski, M Dmoszy)ska Graniczka, A. Semczuk Akademia Medyczna w

Lublinie

„Badanie deregulacji genu p53 w guzach nowotworowych”

11:10 Przerwa

11.20 Prezentacje u ytkowników DNA Pointer System – c.d.

Szperl, Małgorzata, Instytut Kardiologii, Warszawa

„Zastosowanie Systemu DNA Pointer w przeszukiwaniu genów uwikłanych w LQT”,

Fojcik, Hanna, Sl+ska Amademia Medyczna

„Badanie polimorfizmu Ala/Gly 148 w genie PON2 metod PCR-RT-SSCP”

Pi$tkowski, Mariusz, Akademia Medyczna, Gda)sk

„Analiza wystepowania mutacji genu p53 w raku szyjki macicy”

Anna Januszek, Akademia Medyczna, Białystok

„Ocena polimorfizmów egzonu 9 genu glukokinazy w cukrzycy ci #arnych”

Borkowska, Edyta, Maria Constantinou, Bogdan Kału ewski, Uniwersytet Medyczny, Łód5

„Detekcja mutacji genu P53 w raku p cherza moczowego przy u#yciu metody MSSCP”,

Gierczy)ski, Rafał, M. Jagielski, W. Rastawicki, Pa)stwowy Zakład Hihieny, Warszawa

„The identyfication and discrimination between European and American strains of Yersinia

Enterocolitica by PCR-MSSCP technique.”

13.00 Przerwa Obiadowa

13:40 Krzysztof Kucharczyk, Kucharczyk T.E

„Ochrona warto)ci intelektualnych w genetyce”

14:10 Radosław Kaczanowski, Kucharczyk T.E

„Planowanie eksperymentu m. MSSCP a analiza statystyczna wyników ”

14:40 Dyskusja panelowa

Metodyka i praktyka u#ytkowania DNA Pointer System – dyskusja u#ytkowników”

16:30 Zako1czenie Konferencji

I Konferencja U ytkowników DNA Pointer System

STRESZCZENIA WYST PIE

Analiza Molekularna genów PAX9 i MSX1 u chorych z wrodzonym

brakiem zawi zków z!bów stałych.

A. Mostowska, W. H Trzeciak

Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej,

Akademia Medyczna, Pozna!

1. Analiza MSSCP fragmentu zawieraj cego

region koduj cy 3’UTR pozwoliła

wykaza zmiany w ruchliwo>ci

elektroforetycznej pojedynczej nici DNA.

W celu okre>lenia miejsca i typu mutacji

przeprowadzono bezpo>redni analizE

sekwencyjn , która wykazała obecno>

tranzycji CNT zlokalizowanej 6pz od

ko!ca eksonu 2. Substytucja ta powoduje

eliminacjE miejsca restrykcyjnego dla

enzymu DraII. Wykonanie analizy

restrykcyjnej pozwoliło ustali , 0e zmiana

ta jest polimorfizmem, który nie wykazuje

korelacji z wrodzonym barkiem

zawi zków zEbów, poniewa0 została ona

zidentyfikowana tak0e w grupie

kontrolnej, zarówno w stanie hetero- jak

i homozygotycznym (p=0,12).

2. Analiza MSSCP eksonu 2 genu PAX9

pozwoliła wykaza zmiany w ruchliwo>ci

elektroforetycznej pojedynczej nici DNA u

jednego z pacjentów. Analiza sekwencyjna

wykazała obecno> nie opisanej dot d

tranzycji G151A zlokalizowanej w

sekwencji paired box genu PAX9, która

powoduje substytucjE Gly51Ser.Analiza

restrykcyjna 156 kontroli oraz pozostałych

pacjentów, przy u0yciu enzymu PvuII,

pozwoliła na wykluczenie polimorfizmu i

potwierdzenie wystEpowania tranzycji

G151A tylko u jednego pacjenta z

oligodoncj .

Wst p

Wrodzony brak zawi zków zEbów mlecznych

lub stałych jest jedn z najczE>ciej

wystEpuj cych anomalii rozwojowych

człowieka. CzEsto> wystEpowania hipodoncji

w uzEbieniu stałym wynosi od 2 do 10%.

Dotychczas opisano siedem mutacji genów

MSX1 oraz PAX9, koduj cych czynniki

transkrypcyjne, które s przyczyn

wrodzonego braku zawi zków zEbów stałych.

Cel pracy:

Celem projektu było poszukiwanie mutacji

genów MSX1 oraz PAX9 u osób ze

sporadycznym lub te0 wystEpuj cym rodzinnie

brakiem zawi zków zEbów stałych.

Materiały i Metody:

Badaniami objEto grupE 32 osób z hipodoncj

oraz oligodoncj . Genomowy DNA został

wyizolowany z limfocytów krwi obwodowej

metod wysalania. Sekwencje kolejnych

eksonów genów MSX1 oraz PAX

amplifikowano za pomoc reakcji ła!cuchowej

polimerazy (PCR) z wykorzystaniem

specyficznych starterów. W celu wykrycia

mutacji produkty PCR analizowano

elektroforetycznie w 0elu

poliakryloamidowym w zmiennej temperaturze

metod MSSCP lub SSCP, stosowano tak0e

analizE heterodupleksów metod TGGE. W

celu okre>lenia miejsca i typu mutacji

przeprowadzono bezpo>redni analizE

sekwencyjn zmutowanego fragmentu oraz

analizE restrykcyjn z odpowiednio dobranymi

enzymami.

Wnioski:

Brak mutacji w genach MSX1 i PAX9 u

pozostałych 31 osób z wrodzonym brakiem

zawi zków zEbów stałych >wiadczy o tym, 0e

ta wada rozwojowa mo0e by wynikiem

mutacji w innych genach kandydackich

koduj cych zarówno czynniki transkrypcyjne

czy te0 czynniki wzrostowe

Wyniki:

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: