III-Genetyka drożdży.doc

Wprowadzenie do genetyki drożdży Saccharomyces cerevisiae. Cykl życiowy drożdży. Test komplementacji.

Część teoretyczna:

Cechy drożdży jako organizmu modelowego:

Drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae, które są powszechnie wykorzystywane w przemyśle spożywczym, piwowarskim, farmaceutycznym, rolnictwie, znalazły również zastosowanie w biologii molekularnej, umożliwiając zrozumienie i wyjaśnienie wielu procesów zachodzących w komórkach wyższych eukariontów.

·         drożdże są organizmami jednokomórkowymi, ale pod względem złożoności budowy ich komórki nie różnią się od komórek wyższych organizmów, stąd wyniki uzyskane u drożdży są również prawdziwe dla wyższych organizmów, w tym dla człowieka; wiele genów drożdżowych koduje białka, które wykazują nie tylko wysokie podobieństwo w składzie aminokwasowym do białek ludzkich, ale także mają podobne funkcje

·         posiadają wszystkie cechy idealnego organizmu modelowego: krótki czas generacji, liczne potomstwo w krótkim czasie, materiał łatwo dostępny i tani, proste metody hodowli, gatunek niepatogenny, doświadczenia nie stanowią problemów etycznych

·         mały genom (tylko 3,5 razy większy niż u E. coli); zawiera 16 chromosomów, które przypominają strukturą, mechanizmem replikacji, rekombinacji i segregacji swoje odpowiedniki z organizmów wyższych; drożdże są najlepiej poznanym pod względem genetycznym organizmem eukariotycznym; z

·         nana jest obecnie pełna sekwencja DNA genomu drożdży i funkcja 66% genów; mała liczba genów łatwość intronami

·         duża łatwość manipulacji genetycznych np. proste i skuteczne techniki wydajnej transformacji plazmidami, ukierunkowanej inaktywacji genów (u drożdży zachodzi bardzo wydajnie homologiczna rekombinacja), proste metody izolacji kwasów nukleinowych i białek

·         łatwość indukcji mutacji; szybka identyfikacja fenotypu mutacji, dzięki możliwości manipulacji składnikami podłoży hodowlanych o ściśle zdefiniowanym składzie; łatwość izolacji mutacji (drożdże mają stabilny stan diploidalny i haploidalny, dzięki czemu recesywne mutacje mogą od razu manifestować swój fenotyp w komórkach haploidalnych i nie ma potrzeby konstruowania diploidalnych homozygot recesywnych; proste wykonanie testów komplementacji na alleliczność mutacji poprzez krzyżowanie form haploidalnych (zob. niżej)

·         możliwość badania efektów mutacji oddechowych; mutacje te u drożdży nie są letalne, gdyż uruchamiana jest fermentacja alkoholowa jako beztlenowy sposób uzyskiwania energii

·         drożdże mogą być doskonałymi gospodarzami do produkcji i badania białek heterologicznych czyli białek pochodzących od innych organizmów

Genom drożdży S. cerevisiae:

1.      Genom jądrowy:

Genom jądrowy komórki haploidalnej składa się z 16 chromosomów o wielkości od 200 do 2200 tysiąca par zasad stanowią 85% całkowitej informacji genetycznej drożdży; pełna sekwencja genomu jądrowego o długości 12 mln par zasad została opublikowana w 1996 roku; zidentyfikowano 6604 otwartych ramek odczytu (czyli potencjalnych genów), z których 4365 (66,1%) ma opisaną funkcję, 1420 (21,5%) jest nieznanych, a 819 (12,4%) otwartych ramek odczytu uznaje się za „wątpliwe” (ang. „dubious”), które prawdopodobnie nic nie kodują. Informacja genetyczna na chromosomach jest silnie skondensowana (72% sekwencji zajmują geny) i tylko 3,8% genów zawiera introny, które występują licznie w genach kodujących tRNA (w 80 z 262 genów tRNA). Rybosomalne RNA kodowane są tandemowo i występują w 120 kopiach zlokalizowanych na chromosomie XII. Chromosomy zawierają także ruchome elementy genetyczne zwane retrotranspozonami (średnio 30 kopii).

W jądrze znajduje się również 60-100 kopii 2μm (dwumikronowego) plazmidu o długości 6318 par zasad, co stanowi około 5% informacji genetycznej drożdży; funkcja jest nieznana, gdyż szczep ciro nieposiadający tego plazmidu ma identyczny fenotyp jak szczep cir+ zawierający plazmidy. Plazmidy 2μm dziedziczą się niezgodnie z prawami Mendla.

Geny jądrowe (formy zapisu):

·         URA3 – gen typu dzikiego (duże litery, czcionka italic, trzy litery plus liczba)

·         ura3 – allel recesywny (małe litery, czcionka italic)

·         ura3-2 – nazwa allelu recesywnego

·         ura3-Δ1 – mutacja recesywna typu delecji

·         ura3::LEU2 – mutacja przez insercję innego genu typu dzikiego

·         ura3Δ::LEU2 – mutacja delecji przez zastąpienie genu URA3 innym genem typu dzikiego

·         Ura3 lub Ura3p – białko kodowane przez gen URA3

·         Ura+ - szczep nie potrzebujący do wzrostu uracylu (szczep prototroficzny względem uracylu), wykazuje wzrost na podłożu minimalnym bez uracylu

·         Ura− - szczep wymagający do wzrostu uracylu (szczep auksotroficzny względem uracylu), nie wykazuje wzrostu na podłożu minimalnym bez uracylu

·         YAR077w – otwarta ramka odczytu (ORF, potencjalny gen); Y (yeast, drożdże), A (chromosom I), R (right, prawe ramię chromosomu; L, gdy ORF położony jest na lewym ramieniu chromosomu), 077 (kolejny porządkowy numer ORFu na chromosomie), w (położenie ORFu na nici Watsona; ”c” w przypadku nici Cricka)

2.      Genom cytoplazmatyczny:

RNA wirusy zbudowane są z dwuniciowego RNA i stanowią 0,1% informacji genetycznej drożdży; wyróżniamy pięć typów RNA wirusów: L-A (80%), L-BC (9%), M (10%), T (0.5%) i W (0.5%); wirus L-A koduje składniki kapsydu dla własnego RNA i RNA typu M, a RNA M koduje toksynę KIL (ang. killer toxin); dziedziczenie cytoplazmatyczne, niezgodnie z prawami Mendla.

Genom mitochondrialny stanowi 10% informacji genetycznej drożdży. DNA mitochondrialne (mtDNA) występuje w mitochondriach jako kolista, dwuniciowa cząsteczka DNA, ale może mieć również formę liniową. Długość mtDNA wynosi 74-86 tys. par zasad. Średnia liczba kopii w komórce wynosi 50 (8-130). mtDNA bogate jest w pary AT. Geny mitochondrialne szybko ewoluują, gdyż nie występują w mitochondriach skuteczne mechanizmy naprawy DNA (wysokie tempo mutacji). Pełną sekwencję genomu mitochondrialnego poznano w 1998 roku. W skład mtDNA wchodzą dwa geny kodujące rRNA, pełen zestaw genów tRNA (25 genów), gen kodujący białko rybosomalne (var1), gen kodujący RNA wchodzący w skład RNazy P biorącej udział w obróbce tRNA (9S RNA), 7 genów kodujących m.in. białka podjednostek ATPazy, oksydazy cytochromu c i apocytochromu b, a także 9 otwartych ramek odczytu o nieznanej funkcji. Geny mitochondrialne nie podlegają regułom genetyki mendlowskiej.

Trzy geny są podzielone (mozaikowe), tzn. składają się z intronów i eksonów: cox1 (maksymalnie 7 intronów), cytb (maksymalnie 7 intronów), LSU (1 intron). Introny mitochondrialne dzieli się na dwie grupy (I i II) i zdolne są one do samowycinania i przenoszenia się do miejsc homologicznych (introny mobilne). Zdolności te są warunkowane przez białka kodowane przez otwarte ramki odczytu zlokalizowane w samych intronach. Samowycinanie warunkowane jest przez maturazę, a rozprzestrzenianie przez endonukleazę. Przeniesienie intronu grupy I w homologiczne miejsce genu bezintronowego nazywamy „intron homing”, który polega na nacięciu genu bezintronowego przez endonukleazę kodowaną przez intron, a uszkodzenie DNA jest naprawiane na matrycy genu z intronem, czego wynikiem jest wstawienie intronu w nowe miejsce. Introny grupy II mogą kodować białka o potrójnej aktywności: maturazy, endonukleazy i odwrotnej transkryptazy, co umożliwia przeniesienie tego typu intronu w nowe miejsce poprzez odwrotną transkrypcję mRNA genu zawierającego intron w procesie zwanym „retrohoming”.

Typy mutantów oddechowych:

1.      mitochondrialne (dziedziczenie cytoplazmatyczne niezgodnie z prawami Mendla):

a.       rhoo (ρo) - mutacja polegająca na całkowitej utracie mtDNA, efekt fenotypowy jak w rho-,

b.      rho− (ρ−) - duże delecje do 50% genomu mitochondrialnego; wielkość nie ulega zmianie, ponieważ następuje podwojenie pozostałego fragmentu, ale zmienia się jakość

c.       mit− - punktowe mutacje lub niewielkie delecje w mtDNA (utrata aktywności konkretnych genów, synteza pozostałych białek odbywa się bez przeszkód; w przeszłości służyły do konstrukcji mapy genetycznej genomu mitochondrialnego)

d.      rho+ (ρ+) - dziki typ mtDNA

2.      jądrowe (dziedziczenie zgodnie z prawami Mendla):

a.       pet – zmutowane geny jądrowe związane z biogenezą i funkcją mitochondriów

b.      PET- dzikie geny związane z biogenezą i funkcją mitochondriów

PET – skrót od franc. „petite”: mutanty oddechowe tworzą małe kolonie na podłożu z glukozą, gdyż niemożliwy jest szybki wzrost z powodu niedoboru energii uzyskiwanej tylko z fermentacji.jądrowe (tzw. petity jądropet – mutacje w genach zaangażowanych w metabolizm, ekspresję lub strukturę genomu mitochondrialnego; około 300 produktów genów jądrowych może być zaangażowanych w biogenezę mitochondriów

Mutanty mitochondrialne nie są zdolne do wzrostu na podłożach z niefermentowalym źródłem węgla np. mleczanem, etanolem, glicerolem (podłoże N3 lub YPGlic).

Komórki zdolne do oddychania: PET rho+

Komórki niezdolne do oddychania: PET rhoo, PET rho−, PET mit−, pet rho+, pet rhoo, pet rho−

Dziedziczenie cytoplazmatyczne  odnosi się do cech, dla których geny zlokalizowane są poza genomem jądrowym.

Podłoża do hodowli drożdży:

W środowisku naturalnych drożdże występują na powierzchni owoców np. winogron. W laboratorium drożdże hoduje się w temperaturze 30°C na podłożu płynnym w kolbach lub probówkach umieszczonych na wytrząsarce lub na podłożu stałym na płytkach Petriego.

Rodzaje podłoży hodowlanych:

·         pełne YPG (1% Yeast extract – wyciąg drożdżowy, 2% Peptone, 2% Glucose)

·         minimalne G0 (0,67% Yeast Nitogen Base – źródło azotu, 2% glukoza z dodatkiem lub bez suplementów); do selekcji mutantów auksotroficznych (wymagających do wzrostu jakiegoś składnika odżywczego); na podłożu minimalnym bez żadnych dodatków rosną tylko prototrofy

·         pełne N3 (1% Yeast extract – wyciąg drożdżowy, 2% Peptone, 2% Glicerol); do selekcji mutantów oddechowych

·         sporulacyjne SPM (1% octan potasu, 0,1% yeast extract, 0,05% glukoza)

Aby uzyskać podłoże stałe należy dodać także 2% agar.

Cykl życiowy drożdży:

Komórki drożdży mogą występować w dwóch formach haploidalnej i diploidalnej. Komórka diploidalna ma kształt elipsoidalny o wielkości 5 x 6 μm; komórka haploidalna ma kształt sferyczny i średnicę około 4 μm. Cechy te są jednak bardzo zmienne i w mikroskopie świetlnym bardzo trudno jest odróżnić komórkę haploidalną od diploidalnej. Obie formy rozmnażają się przez podziały wegetatywne (mitotyczne) w formie pączkowania, w którym komórka potomna jest inicjowana jako pączek na komórce matczynej; podczas wzrostu pączka następuje podział jądra komórkowego, a jedno z jąder przemieszcza się do pączka potomnego; następnie na granicy komórki matczynej i pączka potomnego tworzy się ściana komórkowa i może nastąpić oddzielenie komórki potomnej (Rys. 1). W pełnym podłożu komórki dzielą się co 90 min, a w minimalnym co 140 min. U diploidów kolejny pączek pojawia się na drugim biegunie komórki (pączkowanie bipolarne), a u haploidów kolejne pączki pojawią się w pobliżu miejsca powstanie pączka poprzedniego (pączkowanie aksjalne) (Rys. 2). Pączki pozostawiają na komórce matczynej charakterystyczne blizny, które mogą być uwidocznione prze fluorescencyjny barwnik calcofluor, który barwi chitynę obecną w miejscu połączenia pączka i komórki matczynej.

Rys. 1. Pączkowanie u drożdży – cykl wegetatywny

Rys. 2. Typy pączkowania.

W warunkach niedoboru składników odżywczych (głód) w komórkach diploidalnych dochodzi do mejozy i powstania 4 haploidalnych spor zamkniętych w worku. Jest to worek nieuporządkowany tzn. spory w worku są ułożone luźno i przypadkowo. W worku znajdują się 2 spory o typie płciowym a (MATa; MAT=mating) i 2 spory o typie płciowym α (MATα). Gdy pojawią się substancje odżywcze spory kiełkują dając początek pokoleniu haploidalnemu typu a lub α (Rys. 3).

Rys. 3. Cykl życiowy drożdży.

Schemat cyklu życiowego S. cerevisiae.

Komórki haploidalne rozmnażają się przez podziały mitotyczne. Połączenie dwóch komórek o przeciwnych typach koniugacyjnych a z a i różnych genomach mitochondrialnych prowadzi do powstania heteroplazmatycznej zygoty (koniugacja). Po kilku lub kilkunastu mitotycznych podziałach komórek diploidalnych a/a następuje segregacja cech mitochondrialnych i powstają homoplazmatyczne diploidy, o genotypach mitochondrialnych rodzicielskich i zrekombinowanych. W wyniku podziałów mejotycznych komórki diploidalnj powstają cztery haploidalne spory (sporulacja) o identycznym genotypie mitochondrialnym. Typ koniugacyjny i pozostałe markery jądrowe segregują w stosunku 2:2.

Kom...