MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA W OCHRONIE ŚRODOWISKA                                        

Ćwiczenie 3

Temat:

Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych - kolorymetryczne oznaczanie stężenia katecholu oraz fenolu w założonych hodowlach (cz. 3).

Zagadnienia teoretyczne:

q       materiał obowiązujący na ćwiczeniu numer 2,

q       komórka prokariotyczna i jej elementy składowe,

q       rodzaje adaptacji mikroorganizmów (genetyczna, socjologiczna, fizjologiczna),

q       definicja biodegradacji i bioaugmentacji,

Część praktyczna:

Materiały:

Ø       probówki

Ø       pipety 100µl, 200 μl, 500 μl, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml

Ø       spektrofotometr

Ø       para-nitroanilina

Ø       2% roztwór NaNO2

Ø       10% Na2CO3

Ø       10% NaOH

Ø       woda destylowana

Ø       10% molibdenian sodu

Ø       0,5 M HCl

Procedura:

Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fenolu i katecholu:

q       do probówek odmierzyć odpowiednie objętości poszczególnych roztworów, zgodnie z tabelkami zamieszczonymi na kartach pomiarowych,

q       zmierzyć ekstynkcję przy odpowiedniej długości fali ( dla fenolu λ = 550 nm, dla katecholu
λ = 480 nm),

q       zrobić wykres krzywej kalibracyjnej. Stężenie fenolu oraz katecholu obliczać z otrzymanego równania krzywej.

A. Oznaczanie stężenia fenolu w założonych hodowlach:

q       do oznaczanie stężenia fenolu wykorzystano metodę polegającą na barwnej reakcji jednowodorotlenowych fenoli z dwuazowaną para-nitroaniliną w środowisku alkalicznym.

q       do probówki pobrać 1 ml supernatantu i dodać 4 ml wody destylowanej (możliwe, że będzie wymagane przygotowanie rozcieńczenia 0,1 ml supernatantu i 4,9 ml wody destylowanej).

q       do tak przygotowanej próbki dodać 1 ml zdwuazowanej para-nitroaniliny. Dwuazowanie polega na wprowadzeniu do odpowiedniej objętości para-nitroaniliny kroplami 2% NaNO2 aż do odbarwienia roztworu.

q       kolejno dodać 0,5 ml 10% Na2CO3 i 1 ml 10% NaOH.

q       tak przygotowaną mieszaninę uzupełnić do 10 ml wodą destylowaną.

q       w spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej, w której supernatant zastąpić wodą destylowaną.

q       stężenie fenolu odczytać na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.

B. Oznaczenie stężenia katecholu w założonych hodowlach:

q       do probówki pobrać 1 ml supernatantu (możliwe, że będzie wymagane przygotowanie rozcieńczenia 0,1 ml supernatantu i 0,9 ml wody destylowanej).

q       dodać kolejno 1 ml 10% Na2MoO4 · 2H2O, 0,5 ml 0,5 M HCl, 0,5 ml NaNO2 oraz 1 ml 10% NaOH.

q       w spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy długości fali 480 nm wobec próby ślepej, w której supernatant zastąpić wodą destylowaną. Stężenie katecholu odczytać na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.

LITERATURA ŹRÓDŁOWA:

1.        KUNICKI-GOLDFINGER W.: „Życie bakterii” -  Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005

2.        CHMIEL A.: „Biotechnologia – podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” –  Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1998

3.        RÓŻALSKI A.: „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej” – Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996

4.        SCHLEGEL G. H.: „Mikrobiologia ogólna” – Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

5.        Źródła internetowe

6.        MIKSCH K.: „Laboratorium podstaw biochemii technicznej” - Dział Wydaw. Politechniki Śląskiej, Gliwice 1978