metody analizy apoptozy bazujące na fragmentacji DNA
Elektroforeza DNA
- charakterystyczny, drabinkowy, obraz DNA kom. apoptotycznej
Test kometowy
- elektroforeza indywidualnych komórek apoptotycznych- głowa – DNA niepofragmentowane- ogon – DNA pofragmentowane
Metoda TUNEL
Przyłączenie do końca 3’OH nukleotydu BdDiPY-dUTP połączonego z fluoresceiną, katalizowane przez terminalną dezoksynukleotydową transferazę TdT. Detekcja wybarwionych fluorescencyjnie pęknięć DNA możliwa jest w mikroskopie fluorescencyjnym lub w cytometrze przepływowym.
Mikroskop świetlny
Używając: fluoresceiny + dUTP, terminalnej dezoksynukleotydowej transferazy TdT, substratu dla ATP i anty-fluoresceinowych przeciwciał skonjugowanych z alkaliczną fosfatazą A
cytometryczne metody analizy apoptozy
Jodek propidyny + enzymy
- jodek propidyny przyłącza się do DNA (czerwona fluorescencja)
- nie wybarwia komórek populacji sub-G1
Analiza zmian w potencjale mitochondrialnym
- rodamina 123 (Rh123) i DioC6 – zmiana intensywności zielonej fluorescencji- JC-1 – zmiana fluorescencji z czerwonej na zieloną
Zmiany w lokalizacji fosfatydyloseryny
- wyznakowanie fosfatydyloseryny aneksyną V
- w komórkach apoptotycznych fosfatydyloseryna znajduje się po zewnętrznej stronie błony
próby ciążowe
Próba Aschheima i Zondeka
U samic myszy nastrzykiwanych moczem lub surowicą z hCG pojawiają się ciałka żółte a u niedojrzałych szczurów dochodzi do zmian rujowych w pochwie
Próba Friedmana
U niedojrzałych królików lub trzymanych w odosobnieniu starych królików, którym podawano dożylnie mocz zawierający hCG, wywołano zmiany w macicy i powstanie świeżych ciałek żółtych
Próba Gall i Mainini
U samic żab (Rana esculenta, Bufo bufo) nastrzykiwanych moczem z hCG wywołano owulację a u samców uwalnianie plemników i jader do kloaki
Histochemiczna metoda lokalizacji acetylocholinesterazy (AChE)
Metoda tiocholinowa i żelazicyjankowa wg. Tago i wsp.
Reakcję przeprowadza się na skrawkach kriostatowych 10-20 mikrometrów utrwalonych i prefundowanych lub skrawkach świeżych.
Metoda Karnovsky’ego i Rootsa: jodek acetylotiocholiny (JATCh) przeprowadzany jest w tiocholinę przez AChE a następnie w Cu2Fe(OH)6 – produkt pierwotny, drobnoziarnisty, brązowy (brąz Hatchetta)Modyfikacja Tago:Cu2Fe(OH)6 w obecności H2O2 utlenia DAB który polimeryzuje i powoduje powstanie brunatnego produktu wtórnego.
Produkt wtórny i pierwotny nierozpuszczalne w ksylenie i alkoholu.
Ocena żywotności/proliferacji komórek
Ocena integralności błony komórkowej
Ocena aktywności enzymów komórkowych uwalnianych do medium: test LDH, dehydrogenazy priogronianowej, dehydrogenazy glutaminianowej, aminotransferazy asparaginianowej
Test wychwytu i gromadzenia barwników: błękit trypanu, czerwień obojętna
Ocena aktywności metabolicznej komórek
Redukcja soli tetrazolowej do formazanu
Test AlamarBlue: podczas proliferacji komórek pozywka zawierająca utlenioną niebieską formę AlamarBlue lega redukcji do formy czerwonej na skutek wzrostu stosunku NADP/NADPH
Perfuzja
Stosowana w celu: wypłukania krwi z narządów, utrwalenia ich, wykonania krioprotekcji lub odlewów naczyń
Po odsłonięciu serca oraz nacięciu lewej komory wprowadza się do aorty wstępującej kaniulę, mocuje się za pomocą zacisków. Następnie nacina się prawy przedsionek w celu umożliwienia wypływu krwi i podania płynów perfuzyjnych
Techniki mrożeniowe
Krojenie skrawków:
- mikrotom mrożeniowy (10-15 μm)
- kriostat (4-10 μm)
Konwencjonalne gwałtowne zamrażanie
Tkanki przepojone krioprotektantem (20-30% glicerol, 15-30% sacharoza, 10% DMSO) zamrażane są w gazach: ciekły azot (-196oC), mieszanina ciekłego i stałego azotu (-208oC), freon 22 (-40oC), freon 12 (-30oC), ciekły izopropanol (-42oC), hel (-89oC)
Ultraszybkie zamrażanie
Zamrażanie przez zatapianie: kriogen w pojemniku (ciekły propan lub etan)
Zamrażanie przez rozpylanie: małe fragmenty tkanek (zawiesiny komórkowe, organella, membrany)
Zamrażanie w strumieniu gazu: ciekły gaz wyrzucany z dyszy na próbkę
Zamrażanie przez uderzanie: materiał umieszczony w uchwycie uderza o płytkę miedzianą ochłodzoną w ciekłym helu
Zamrażanie pod wysokim ciśnieniem
Pozwala na obniżenie tempa ochładzania tkanki
Radioimmunologiczne metody oznaczania stężeń hormonów steroidowych
RIA
Metoda oparta na współzawodnictwie znakowanych (gorących) i nieznakowanych (zimnych) form tego samego steroidu o ograniczoną ilość miejsc wiązania na cząsteczkach swoistych przeciwciał. Pomiędzy ilością zimnego steroidu a steroidu gorącego istnieje zależność odwrotnie proporcjonalna .
Metody wykrywania promieniowania jonizującego
scyntylacyjna (luminescencyjna)
Swiecenie pewnych substancji chemicznych pod wpływem napromieniowania
fotograficzna
Zaczernienie światłoczułej emisji na kliszy pod wpływem promieniowania jonizującego
chemiczna
Niektóre substancje zmieniają zabarwienie pod wpływem promieniowania
jonizacyjna
Pomiar stopnia jonizacji atomów substancji będących pod działaniem promieniowania jonizacyjnego
Testy aktywności cytotoksycznej
NR (Neutral Red)
Czerwień obojętna przechodzi przez błonę komórkową komórek żywych i gromadzi się w lizosomach
Błękit trypanu
Barwi wyłącznie komórki martwe
Test LDH
Metoda ta oparta jest na reakcjach enzymatycznych w wyniku których powstaje barwny produkt, oznaczany spektrofotometrycznie przy użyciu czytnika ELSA. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest enzymem cytozolowym, który w warunkach fizjologicznych nie jest uwalniany do środowiska. Uszkodzenie mechaniczne błony plazmatycznej oraz śmierć komórki powoduje uwolnienie LDH z komórek do środowiska
TasartirIreth