14_Chromatografia_Cienkowarstwowa.pdf

14. CHROMATOGRAFIA

CIENKOWARSTWOWA

1. Chromatografia cienkowarstwowa aminokwasów

Zasada:

Technik ę chromatografii cienkowarstwowej wyró Ŝ nia kształt i rodzaj fazy sta-

cjonarnej, uformowanej w postaci cienkiej warstwy nało Ŝ onej na płaskie podło-

Ŝ e, zapewniaj ą ce dostateczn ą wytrzymało ść mechaniczn ą . Płaskim podło Ŝ em

zwykle s ą płytki szklane, płytki z folii aluminiowej lub plastykowej. Cienk ą

warstw ę zło Ŝ a mog ą stanowi ć : Ŝ el krzemionkowy (Kiselgel, silica gel), ziemia

okrzemkowa (Kiselgur, celit, diatomaceous earth), niezmodyfikowana lub zmo-

dyfikowana chemicznie celuloza, tlenek glinowy (Al 2 O 3 ), podło Ŝ a jonowy-

mienne lub inne. Warstw ę wybranego zło Ŝ a mo Ŝ na nało Ŝ y ć na płytki samo-

dzielnie, wykorzystuj ą c do nakładania zawiesiny specjalny przyrz ą d zwany po-

wlekaczem. Przygotowywane samodzielnie płytki nale Ŝ y zaktywowa ć przed na-

ło Ŝ eniem prób. W tym celu umieszcza si ę płytki w suszarce o temperaturze

120 0 C na 10 minut. Mo Ŝ na korzysta ć te Ŝ z gotowych płytek powleczonych

okre ś lonym zło Ŝ em, które s ą dost ę pne w sprzeda Ŝ y. Technik ę chromatografii

cienkowarstwowej stosuje si ę do rozdziału niemal wszystkich grup zwi ą zków

wa Ŝ nych biologicznie. Zazwyczaj rozdział zachodzi na zasadzie odwracalnej

adsorpcji na powierzchni fazy stałej (chromatografia adsorpcyjna) lub podziału

substancji mi ę dzy dwie fazy ciekłe (chromatografia podziałowa).

Wykonanie:

Na gotowej płytce zaznaczy ć delikatnie ołówkiem lini ę startu w odległo ś ci

1,5 cm od brzegu płytki. Na wykre ś lonej linii startu zaznaczy ć 12 punktów

w odst ę pach 1,5 cm, rozpoczynaj ą c w odległo ś ci 1,5 cm od brzegu płytki.

W punktach tych zostan ą naniesionie kolejne roztwory aminokwasów wzor-

cowych (0,5%) oraz mieszaniny nr 1–3, zawieraj ą ce aminokwasy przezna-

czone do identyfikacji. Na górnym brzegu płytki, przeciwległym do punktów

zaznaczonych na linii startu, nale Ŝ y zapisa ć nazwy lub numery nanoszonych

wzorcowych aminokwasów i nieznanych mieszanin.

Nanoszenie prób wzorcowych i badanych

Za pomoc ą kapilary nanosimy w zaznaczonych punktach wzorce aminokwasów

w kolejno ś ci zapisanej na górnym brzegu płytki. Nanoszenie wykonujemy

przez delikatne dotkni ę cie ko ń ca kapilary do podło Ŝ a płytki, tak aby ś rednica

powstałej plamki roztworu na płytce nie była wi ę ksza ni Ŝ 3 mm. Podczas nano-

szenia prób plamki suszymy strumieniem ciepłego powietrza z suszarki.

Rozwijanie chromatogramu

Chromatogramy cienkowarstwowe rozwija si ę w specjalnie przystosowanych

komorach chromatograficznych ze szlifowan ą szczeln ą pokryw ą . Przed u Ŝ y-

ciem wewn ę trzne dwie wi ę ksze ś ciany komory wyło Ŝ y ć bibuł ą filtracyjn ą . Do

komory nale Ŝ y wla ć ok. 120 ml mieszaniny rozpuszczalników słu Ŝą cych do

rozwijania chromatogramu, składaj ą cej si ę z n-butanolu, kwasu octowego, wo-

dy w stosunku obj ę to ś ciowym 4:1:1, przynajmniej na 25 minut przed wstawie-

niem płytek. Roztwór rozpuszczalników rozwijaj ą cych chromatogram wlewa ć

tak, aby bibuła była dokładnie nas ą czona i na dnie komory została warstwa roz-

tworu. Takie przygotowanie komory chromatograficznej zapewnia maksymalne

wysycenie wn ę trza komory chromatograficznej parami rozpuszczalników. Płyt-

k ę chromatograficzn ą z naniesionymi próbami chwyci ć za górn ą kraw ę d ź (uni-

kaj ą c dotykania palcami dolnej cz ęś ci płytki). Wstawi ć płytk ę pionowo do ko-

mory chromatograficznej (kraw ę d ź płytki z lini ą startu ma by ć zwrócona ku do-

łowi), ostro Ŝ nie wsuwaj ą c mi ę dzy równoległe rowki przeciwległych ś cian ko-

mory. Kraw ę dzie boczne płytki nie mog ą dotyka ć bibuły, poniewa Ŝ mo Ŝ e to

spowodowa ć nierównomierne wznoszenie si ę rozpuszczalnika. Rozwijanie

chromatogramu prowadzi ć przez 60 minut w szczelnie zamkni ę tej komorze. Po

tym czasie płytk ę wyj ąć z komory chromatograficznej i zaznaczy ć ołówkiem

front wzniesienia eluentu. Nast ę pnie płytk ę wysuszy ć pod dygestorium, w

strumieniu ciepłego powietrza z termowentylatora.

Wywołanie chromatogramu

Wysuszon ą płytk ę , po ustawieniu pionowo pod dygestorium, spryska ć z rozpy-

lacza roztworem 0,3% kwa ś nej ninhydryny w butanolu, tak aby rozpylany roz-

twór nie spływał po płytce. Płytk ę ogrzewa ć strumieniem gor ą cego powietrza

a Ŝ do pojawienia si ę zabarwionych plamek aminokwasów.

Interpretacja chromatogramu

Uwidocznione plamki obrysowa ć ołówkiem, wyznaczy ć ś rodek plamki i zmie-

rzy ć odległo ść od miejsca startu do ś rodka plamki, czyli drog ę przebyt ą przez

ka Ŝ dy aminokwas. Zmierzy ć drog ę przebyt ą przez rozpuszczalnik. Obliczy ć

warto ś ci współczynników R f dla wszystkich wzorcowych aminokwasów i skład-

ników mieszanin nieznanych aminokwasów. Na podstawie warto ś ci R f zidenty-

fikowa ć skład rozdzielonych mieszanin aminokwasów.

2. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów osocza

Zasada:

Chromatografia cienkowarstwowa, ze wzgl ę du na łatwo ść wykonania, mini-

malne potrzeby aparaturowe i niski koszt, mo Ŝ e by ć metod ą z wyboru do roz-

działu lipidów osocza. Ekstrakt chloroformowy lipidów osocza (patrz ć wiczenie

8) mo Ŝ na rozdzieli ć wst ę puj ą c ą technik ą chromatografii cienkowarstwowej na

Ŝ elu krzemionkowym, stosuj ą c układ rozpuszczalników: eter naftowy, st ęŜ ony

kwas octowy, eter etylowy w stosunku obj ę to ś ciowym 39:1:10. Technika ta po-

zwala rozdzieli ć i uwidoczni ć na chromatogramie frakcj ę estrów cholesterolu,

triacylogliceroli, wolnych kwasów tłuszczowych, cholesterolu i fosfolipidów.

Wykonanie:

Ć wiczenie nale Ŝ y wykona ć w ten sam sposób, jak ć wiczenie 1, w którym opi-

sano szczegółowo poszczególne etapy procedury.

Nanoszenie prób badanych i wzorcowych. Po przygotowaniu płytek, jak

opisano wcze ś niej, na starcie w dwóch miejscach nało Ŝ y ć kapilar ą chloro-

formowy ekstrakt lipidów. Jako próby wzorcowe nanie ść 2% chloroformowy

roztwór cholesterolu, roztwór fosfolipidów i roztwór triacylogliceroli.

Rozwijanie chromatogramu technik ą wst ę puj ą c ą . Do komory chromato-

graficznej wla ć 120 ml eluentu o składzie eter naftowy, st ęŜ ony kwas octowy,

eter etylowy w stosunku obj ę to ś ciowym 39:1:10. Płytki z nało Ŝ onymi próba-

mi wstawi ć do komory na 60 minut, jak opisano poprzednio, w celu rozwi-

ni ę cia chromatogramu. Po tym czasie płytk ę wyj ąć z komory chromatogra-

ficznej i zaznaczy ć ołówkiem front wzniesienia eluentu. Nast ę pnie płytk ę

wysuszy ć pod dygestorium w strumieniu ciepłego powietrza z termowentyla-

tora.

Wywołanie chromatogramu. Wysuszon ą płytk ę wstawi ć na kilka minut do

komory z J 2 w celu wybarwienia rozdzielonych frakcji lipidów. Pojawiaj ą ce

si ę Ŝ ółtobrunatne zabarwienie wynika z wysycenia jodem podwójnych wi ą -

za ń rozdzielanych zwi ą zków. Alternatywnie, drug ą płytk ę spryska ć odczyn-

nikiem utleniaj ą cym (0,6% dwuchromian potasowy w 50% kwasie siarko-

wym).

Interpretacja chromatogramu. Obliczy ć warto ś ci współczynników R f dla

wszystkich wzorcowych substancji oraz poszczególnych składników rozdzie-

lanego ekstraktu lipidów, które nale Ŝ y zidentyfikowa ć .

ODCZYNNIKI

Płytki pokryte Ŝ elem krzemionkowym; 0,2% roztwory aminokwasów wzorco-

wych: cystyna, arginina (Arg), glutamina (Gln), asparagina (Asn), treonina

(Thr), leucyna (Leu), tyrozyna (Tyr), tryptofan (Trp), prolina (Pro); mieszaniny

aminokwasów do identyfikacji: 1, 2, 3; roztwór elucyjny 1: n-butanol-kwas

octowy-woda (w stosunku obj ę to ś ciowym 4:1:1); 0,3% roztwór kwa ś nej nin-

hydryny w butanolu (0,3 g ninhydryny + 100 ml butanolu + 3 ml kwasu octo-

wego); ekstrakt chloroformowy lipidów z osocza (25 mg/ml); roztwór elucyjny

2: eter naftowy-st ęŜ ony kwas octowy-eter etylowy (w stosunku obj ę to ś ciowym

39:1:10); 2% roztwór chloroformowy cholesterolu; fosfolipidów; triacyloglice-

roli; J 2 , 0,6% dwuchromian potasu w 50% kwasie siarkowym.

NOTATKI

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: