BIOLOGIA MOLEKULARNA

WYKŁAD 5 - 3.11.2006

Cechą charakterystyczną transkrypcji i translacji u mikroorganizmów- u Procaryota - jest specyficzne ich sprzężenie. Oznacza to, że w miarę tworzenia się kompleksu transkrypcyjnego, mRNA po bardzo krótkim okresie czasu od jego utworzenia (tak więc jest wtedy krótką cząsteczką) jest przyłączane do rybosomu (w obecności odpowiednich sekwencji) i następuje proces translacji. Będzie to miało reperkusje przy niektórych mechanizmach regulacji, jakie zachodzą u bakterii.

·         Kompleks inicjacyjny u bakterii składany jest bezpośrednio przez kodony inicjacyjne

·         Proces ten rozpoczyna się od przyłączenia czynnika inicjującego  do rybosomu (sekwencja Shine-Dalgarno)

·         Odczytywanie informacji genetycznej jest zgodne z kodem genetycznym.

Co bierzemy pod uwagę, gdy chcemy klonować geny Mycoplasmy w E. coli:

·         Są to Procaryota, więc takie sprawy jak wycinanie intronow, alternatywne składanie, itp. możemy pominąć;

·         Uniwersalność kodu genetycznego;

·         Klonowanie zajdzie, lecz ekspresja genu będzie bardzo słaba tzn. że otrzymamy niewielką ilość klonowanego białka.

Organizmy różnią się między sobą częstością występowania kodonów i, co z tym związane, liczbą cząsteczek tRNA dla poszczególnych kodonów, np. Mycoplasma odbiega od innych bakterii pod względem częstości użycia określonych kodonów. Jeśli gen, którego ekspresję chcemy uzyskać np. w komórkach E.coli, zawiera kodony wyjątkowo rzadko wykorzystywane przez bakterie, może to prowadzić do szybkiego wyczerpania tRNA dla tych kodonów. W efekcie translacja zostaje wstrzymana, synteza białka spowolniona a mRNA degradowane. Rozwiązaniem omawianego problemu może być zamiana rzadkiego kodonu na kodon częściej wykorzystywany przez gospodarza.

Innym sposobem może być kotransformacja komórek wektorem ekspresyjnym niosącym gen tRNA dla rzadkiego kodonu. Istnieją też komercyjnie dostępne szczepy bakteryjne pozwalające ominąć problem występowania rzadkich kodonów. .

Mniej więcej 400 genomów bakteryjnych zostało już zsekwencjonowanych (dane z września 2006). Prze pomocy nowoczesnej technologii taki proces trwa 3 dni:

I.                    integruje się chromosomalne DNA: trawi odpowiednimi enzymami i klonuje;

II.                 izoluje się DNA klonów i sekwencjonuje;

III.              programy komputerowe zczytują dane i składają całą sekwencję.

Koszt takiego sekwencjonowania wynosi 8000$.

Jeśli firma komercyjna chciałaby mieć taki klon to bardzie jej się opłaca wydać te 8tys i zrobić swojego klona niż czekać (w Stanach nawet i pół roku - przepisy są tam takie, że jeśli ktoś chce uzyskać klon od jakiegoś naukowca to musi on uzyskać zgodę swojej uczelni, co może trwać bardzo długo).

Sekwencją odpowiedzialną za przyłączanie rybosomów, od której zaczyna się zaraz potem synteza bialka jest tzw. RBS (ribosome-binding site - sekwencja najwyzszej zgodności) .

Przykładowe sekwencje:

·         Procaryota - sekwencja Shine-Dalgarno. U Escherichia coli- GGAGG
Sekwencja zlokalizowana 5 do 13 nukleotydów przed pierwszym kodonem ATG. Sekwencja Shine-Dalgarno jest komplementarna do 3' końca 16S rRNA wchodzącego w skład małej podjednostki 30S rybosomu.

·         Saccharomyces cerevisiae - sekwencja bogata w A. (A/Y)A(A/T)AATGTCT,

·         Kręgowce - Sekwencja Kozak. Konsensus: GCC(A/G)CCATGG,

Sekwencja działa spowalniająco na rybosom przesuwający się wzdłuż mRNA, przez co zwiększa prawdopodobieństwo rozpoznania kodonu start

·         Wirusy eukariotyczne - IRES (z ang.: internal ribosome entry site). Sekwencja umożliwiająca translację dwóch otwartych ramek odczytu z pojedynczego mRNA. IRES umieszczony jest między dwiema sekwencjami kodującymi białka i ma długość kilkuset nukleotydów.

o       Sekwencje IRES posiadają też niektóre RNA jądrowe

·         U owadów - sekwencja analogiczna do sekwencji Kozak. CAAAACATG

Sekwencja najwyższej zgodności nie jest zawsze w 100% zgodna. Wystepują odstępstwa w postaci pojedyńczych nukleotydow, niemniej jednak jest to najlepsza sekwencja do przyłączenia się rybosomu.

Rybosomy

Przy dzisiejszym stanie wiedzy nie można odpowiedzieć na pytanie, czy rybosom jest enzymem, czy rybozymem, wiemy natomiast, że w centrum katalitycznym nie ma białka

tRNA

U bakterii pierwszem aminokwasem jest metionina             

Istnieją trzy kodony stop :

·        UAG              – Amber

·        UAA              – Ochre

·        UGA              – Opal

Zdarza się, że niektóre bakteriofagi i Procaryota odczytują ten sam gen tworząc dwa białka: jedno krótsze a drugie dłuższe, gdzie krótsze jest początkiem dluższego. Dzieje się tak dlatego, że opal i ochre są słabymi kodonami terminacyjnymi – niektóre tRNA mogą je rozpoznać i synteza białka zachodzi dalej.

Wydajność dodawania niespecyficznego aminokwasu jest dosyć niska, dłuższe białko powstaje średnio w 5-10% przypadków. Zwiększa to jednak pojemność genetyczną, gdyż ok. 80% tej samej sekwencji jest wykorzystane w dwóch białkach.

Zmiana ramki odczytu

·         również zwieksza pojemność genetyczną – 1kod à 3 wersje białek

·         u prokariota zwykle wynosi -1 (??? – przyp. Marta)

Były to przykłady regulacji i wykorzystania informacji genetycznej w trakcie elongacji w procesie translacji.

U prokaryota synteza białka zazwyczaj startuje od kodonu AUG(metionina). Od tej reguły możemy mieć następujące odstępstwa:

·         Skanowanie: rybosomy czasami pomijają pierwszy napotkany kodon inicjacyjny tylko lekko na nim zwalniając i rozpoczynają syntezę od następnego AUG (czasami zdarzają się przypadki przeskoczenia dwóch kodonów);

·         Reinicjacja: translacja zaczyna się od pierwszego kodonu inicjującego, przesuwa się normalnie i w pewnym momencie przeskakuje jakiś kawałek kodu (jakby nie odczytało się kilka a nawet więcej kodonów) po czym od jakiegoś momentu idzie normalnie dalej;

·         Zmiana ORFu;

·         Poślizg: translacja zaczyna się od pierwszego kodonu inicjującego, następnie kilka kodonów jest pominiętych i aminokwasy nie są przyłączane, po czym następuje normalna translacja.

Istnieje szereg mechanizmów regulacyjnych (czyli odstępstw od normalnego odczytu) w momencie inicjacji i elongacji procesu translacji, pozwala to na większą różnorodność i znacznie zwiększa pojemność genetyczną. U podstaw tych wszystkich mechanizmów leży struktura RNA. W ponad 80% cząsteczki RNA są dwuniciowe, o mocno rozbudowanej strukturze II i III rzędowej

Modyfikacja potranslacyjna jest to:

1.      Obróbka proteolityczna-proteazy usuwają zbędne fragmenty

¨      aktywacja białka poprzez usunięcie zbędnych fragmentów

¨      usunięcie sekwencji liderowych (które potrzebne są białku aby przemieścić się do struktur bon komórkowych lub na zewnątrz komórki, występują na N-końcu. Bardzo często bez odcięcia sekwencji liderowej aktywność białka jest bardzo niska lub wręcz jej nie ma.)

¨      splicing polipeptydowy - usunięcie fragmentów (tzw. inteiny) ze środka

¨      usunięcie pierwszych podstawników

2.      N-acetylacja, N-metylacja, N-formylacja- dołączenie grupy acetylowej, metylowej lub metioniny (na N-końcu powstałego peptydu)

3.      Hydroksylacja - dołączenie grupy OH

4.      Fosforylacja - aktywacja białka przez dołączenie grupy fosforylowej

5.      Defosforylacja - deaktywacja grupy fosforanowej przez odłączenie grupy fosforylowej

6.      Polirybozylacja - dołączenie adeniny

7.      Dołączenie lipidów i metali

8.      Glikozylacja - dołączenie reszt cukrowych do białka

¨      Glikozylacja białek u prokaryota nie jest tak rozbudowana jak u eukariota niemniej jednak zachodzi.

Za specyficzne przyłączanie  się różnych grup odpowiedzialna jest II i III rzędowa struktura białka.

Gdzie najlepiej uzyskiwać ekspresję eukariotycznego genu aby dostać białko prawie dokładnie tak zmodyfikowane jak w komórce źródłowej?

Odp.: w komórkach owadzich – proces posttranslacyjnej modyfikacji zachodzi tam najwierniej i z największą dokładnością w porównaniu do organizmów natywnych.

Domeny transbłonowe (transmembranowe) – wynikają ze struktury posttranslacyjnej ‑ budowy przestrzennej białka. Gdy taka domena występuje oznacza to,...