Monika Kuś środa, godz.8.30, 9.11.2011r
Aneta Latacz Prowadzący: Paweł Mak
Paulina Oklejewicz
Sprawozdanie 3
Wyznaczanie stałej Michaelisa dla arylosulfatazy A
Arylosulfatazy są enzymami, które katalizują hydrolizę estrów siarczanowych fenoli według reakcji:
R-S-SO3H + H2O à R-OH + SO4-2 + H+
Podczas ćwiczeń użyto siarczanu p-nitrokatecholu. Uwolniony 4-nitrokatechol oznaczono spektrofotometrycznie przy 515nm.
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia było wyznaczenie stałej Michaelisa-Menten dla substancji: arylosulfatazy A. Dla każdego z użytych substratów wykreślono krzywe kinetyczne. Znaleziono graficznie szybkości początkowe, a po sporządzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczono graficznie wartości Km i Vmax.
Sposób wykonania:
W probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml sporządzono mieszaninę reakcyjną: 0,6 ml homogenatu wątroby, który był źródłem arylosulfatazy, 0,6 ml substratu, 0,6 ml 0,5M buforu octanowego zawierającego 10% NaCl.
Mieszaninę wytrząśnięto, inkubowano w temperaturze 37 stopni i po czasie 2,4,6,8 i 10 minut pobierano po 300 µl i przenoszono do 5 przygotowanych uprzednio probówek typu Eppendorf 1,5 ml, zawierających 1ml 0,5M NaOH.
Po wymieszaniu zmierzono absorbancję przy 515 nm ( właśnie tam było 515 czy 400 coś?) na spektofotometrze względem ślepej odczynnikowej.
Ślepą odczynnikową przygotowano w sposób następujący: 100 µl 0,5M buforu octanowego zawierającego 10% NaCl, 100 µl substratu i 100 µl wody inkubowano w temperaturze 37 stopni i po 5 minutach dodano 1ml 0,5M NaOH.
Opisane oznaczenie wykonano dla 6 różnych stężeń substratu w zakresie od 20 do 120 mg/10ml.
Wyniki:
1.Wyniki absorbancji dla poszczególnych stężeń substratów
a) 20mg/10ml
1) 0,125
2) 0,135
3) 0,145
4) 0,165
5) 0,170
b) 40mg/10ml
1) 0,100
2) 0,110
3) 0,125
4) 0,135
5) 0,165
c) 60mg/10ml
1) 0,115
2) 0,125
3) 0,155
4) 0,170
d) 80mg/10ml
1) 0,165
2) 0,220
3) 0,230
4) 0,320
5) 0,375
e) 120mg/ml
Tych danych już nie mam na mojej kartce
1)
2)
3)
4)
5)
2. Przeliczenie
paulinka88x