sprawozdanie biochemia 25.11.doc

Natalia Maciejewska, Paulina Rusinek, Aleksandra Smędzik                             gr. Pon. 12.15

1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla arylosulfatazy A (EC 3.1.6.1).

Cel : Arylosulfatazy są enzymami katalizującymi in vitro hydrolizę estrów siarczanowych fenoli wg następującej reakcji :

R-O-SO3H + H2O -> R-OH + SO42- +H+

Celem ćwiczenia było wykreślenie krzywej Michaelisa dla enzymu arylosulfataza A.

- W probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml sporządzono mieszaninę reakcyjną zawierającą 0,6 ml homogenatu wątroby, 0,6 ml substratu i 0,6 ml 0,5M buforu octanowego pH 5,0 zawierającego 10% NaCl

- Mieszaninę inkubowano w temp. 37oC

- Po czasie 2, 4, 6, 8, 10 min. Pobrano po 300 mikrolitrów i przeniesiono do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 1ml 0,5M NaOH

- Po wymieszaniu zmierzono absorbancję przy 515nm na spektrofotometrze względem ślepej odczynnikowej

- Ślepą odczynnikową przygotowano dodając do 100 mikrolitrów 0,5M buforu octanowego pH 5,0 zawierającego 10% NaCl 100mikrolitrów substratu i 100mikrolitrów H2O

-Ślepą odczynnikową inkubowano w temp. 37oC i po 5min. Dodano 1ml 0,5M NaOH.

-Opisane oznaczenie wykonano dla 6 różnych stężeń substratu w zakresie od 20 do 120 mg/ml.

Otrzymano następujące wyniki:

Tabela 1. Wartość absorbancji w zależności od stężenia substratu oraz czasu trwania reakcji enzymatycznej.

Wiedząc, że:

1μmol katecholu ma absorbancję 3,2 dla objętości próbki 1,3ml

Przeliczono korzystając z proporcji ile μmol produktu znajduje się w każdej z badanych prób.

Tabela 2. Ilość wydzielonego produktu w μmol w zależności od stężenia substratu i czasu trwania reakcji enzymatycznej.