1. MIKROSKOPY ŚWIETLNE
Mikroskopy świetlne (optyczne) wykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznych i umożliwiają uzyskiwanie powiększeń rzędu 10-1500 ´.
1.1. Budowa mikroskopu świetlnego
W skład każdego mikroskopu świetlnego wchodzą dwa zespoły części: zespół mechaniczny i zespół optyczny.
1.1.1. Zespół mechaniczny
Zespół mechaniczny zbudowany jest z następujących elementów:
· podstawa mikroskopu, z reguły masywna, zapewniająca jego stabilność;
· statyw, do którego przymocowany jest stolik przedmiotowy i tubus (p. dalej);
· stolik przedmiotowy, posiadający w środku okrągły otwór dla przejścia wiązki promieni świetlnych. Stolik wyposażony jest w poruszane współosiowymi pokrętłami prowadnice, umożliwiające przesuwanie preparatu w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach. Dodatkowa kalibracja (na prowadnicach lub pokrętłach) pozwala na liczbowe określenie współrzędnych dowolnego miejsca w preparacie i szybkie odszukanie go przy powtórnym oglądaniu;
· tubus, na którego przeciwległych końcach zamocowane są podstawowe elementy optyczne tworzące obraz: okular i obiektyw. We współczesnych mikroskopach stosuje się tzw. tubus łamany, w którym osie optyczne obiektywu i okularu tworzą ze sobą pewien kąt, co umożliwia wygodne mikroskopowanie;
· rewolwer - obrotowa tarcza znajdująca się na dolnym końcu tubusa, do której wkręca się 3‑6 obiektywów. Dzięki obecności mechanizmu zatrzaskowego umożliwia szybkie ustawienie pożądanego obiektywu w osi optycznej (zmianę powiększeń);
· śruba makrometryczna i mikrometryczna. Precyzyjne ustawienie ostrości obrazu wymaga regulacji odległości pomiędzy preparatem a obiektywem, czyli pomiędzy stolikiem przedmiotowym a tubusem. W zależności od konstrukcji mikroskopu elementem ruchomym może być bądź stolik bądź tubus, a przesuwu dokonuje się za pośrednictwem dwóch zazwyczaj współosiowych pokręteł umieszczonych w statywie mikroskopu: śruby makrometrycznej (szybkiego przesuwu) oraz mikrometrycznej (wolnego przesuwu). W niektórych mikroskopach stosuje się tylko jedno pokrętło (wolnego przesuwu).
1.1.2. Zespół optyczny
W skład zespołu optycznego wchodzą:
· źródło światła. Mikroskopy badawcze posiadają wbudowane w podstawę własne źródło światła (żarówkę halogenową lub ksenonową) o regulowanej jaskrawości świecenia, wyposażone w przesłonę. Mikroskopy szkolne wyposażone są w dwustronne lusterko mogące obracać się we wszystkich płaszczyznach. Za jego pośrednictwem można korzystać z zewnętrznych źródeł światła (światło dzienne lub lampa);
· filtry. Mikroskopy badawcze wyposażone są w kilka barwnych filtrów (niebieski, zielony, żółty, czerwony), pomocnych przy kontrastowaniu obrazu mikroskopowego i przy wykonywaniu mikrofotografii, a także w filtr ciemny (szary), zmniejszający jaskrawość obrazu przy niższych powiększeniach;
· przesłona, umieszczona z reguły przed (pod) kondensorem pozwala na regulację jasności pola widzenia i kontrastowości obrazu;
· kondensor. Jest to układ soczewek skupiający wiązkę promieni świetlnych wysyłanych ze źródła światła, w celu oświetlenia pola widzenia w preparacie. Apertura numeryczna kondensora powinna być zgodna z aperturą obiektywu (p. dalej). Kondensor można przesuwać pionowo za pomocą odrębnego pokrętła, co umożliwia regulację oświetlenia pola widzenia; operując kondensorem i przesłoną można ustawić optymalne oświetlenie preparatu, tzw. oświetlenie Köhlera (w nowoczesnych mikroskopach uzyskuje się je automatycznie),
· obiektyw - jeden z dwóch (oprócz okularu) elementów tworzenia obrazu powiększonego. Jest to układ soczewek dobranych w ten sposób, aby zniwelować wady optyczne pojedynczej soczewki: aberrację sferyczną i chromatyczną[1].
W zależności od stopnia i sposobu korekcji tych wad wyróżnia się kilka typów obiektywów:
- obiektywy monochromatyczne: ze skorygowaną aberracją chromatyczną w zakresie określonej części widma światła białego;
- obiektywy achromatyczne: ze skorygowaną aberracją chromatyczną w zakresie środkowej części widma światła białego;
- obiektywy planachromatyczne: jw., z dodatkowo skorygowaną aberracją sferyczną;
- obiektywy apochromatyczne: ze skorygowaną aberracją chromatyczną w zakresie prawie całego widma światła białego;
- obiektywy planapochromatyczne: jw., z dodatkowo skorygowaną aberracją sferyczną.
Obiektywy planachromatyczne i planapochromatyczne pozwalają na korzystanie z dużego pola widzenia i okularów o znacznych powiększeniach.
Obiektywy można również podzielić na tzw. obiektywy suche (małych i średnich powiększeń) oraz obiektywy immersyjne (dużych powiększeń). Przy używaniu tych ostatnich należy wypełnić przestrzeń pomiędzy preparatem a soczewką czołową obiektywu olejkiem immersyjnym, którego współczynnik załamania światła jest taki sam, jak współczynnik szkła. Unika się w ten sposób ugięcia (dyfrakcji) promieni świetlnych na granicy szkła i powietrza, które przy dużych powiększeniach niekorzystnie wpływa na jakość obrazu.
Na obudowie każdego obiektywu znajdują się podstawowe dane dotyczące jego charakterystyki: powiększenie oraz apertura numeryczna (p. dalej). Najczęściej stosowane powiększenia obiektywów to: 5, 10, 20, 40 (suche), 60 i 90‑100 ´ (immersyjne);
· pośrednie układy optyczne. Pomiędzy obiektywem a okularem znajdują się zazwyczaj tzw. pośrednie układy optyczne, zależne od typu i konstrukcji mikroskopu. Najczęściej spotykamy zwierciadła załamujące promienie świetlne pod określonym kątem, zgodnym z kątem załamania tubusa. W mikroskopach badawczych montuje się także układy pryzmatów lub półprzepuszczalnych luster rozdzielających promienie na dwie odrębne wiązki dające taki sam obraz: jedną skierowaną do okularu, a drugą do połączonego z mikroskopem urządzenia peryferyjnego (np. aparat fotograficzny, kamera cyfrowa, wideokamera). Mogą się tu również znajdować soczewki dodatkowo powiększające obraz odbierany przez urządzenie peryferyjne, bądź przez okular.
· okular: ostatni element zespołu optycznego. Jest to układ soczewek działający na zasadzie lupy, za pomocą którego oglądany jest obraz mikroskopowy. Powiększenie okularu (5‑15 ´) oznaczone jest na jego obudowie. Specjalną odmianę stanowią okulary zapewniające szczególnie duże pole widzenia. W najprostszych mikroskopach szkolnych stosuje się pojedynczy okular. W mikroskopach badawczych używa się okularu podwójnego (binokularu) o regulowanym rozstawie, który umożliwia wygodniejsze i mniej męczące wzrok obuoczne oglądanie obrazu.
Elementy składowe mikroskopu świetlnego przedstawia ryc. 1.1.
Najbardziej zaawansowane technicznie badawcze mikroskopy świetlne wyposażone są w mechaniczny napęd wszystkich części ruchomych, a także - dzięki zastosowaniu mikroprocesorów lub sprzężeniu z komputerem - pełną automatykę obsługi. Ustawienia przesłony, kondensora oraz oświetlenia dostosowują się automatycznie do wybranego obiektywu, można zapisać w pamięci elektronicznej wybrane położenia stolika przedmiotowego a następnie automatycznie je odtwarzać (oszczędza to czasochłonnego przeszukiwania preparatów w celu odnalezienia uprzednio oglądanych szczegółów), przy zmianach obiektywów następuje automatyczne ustawienie ostrości obrazu (autofocus). Mikroskopy te są również przystosowane do współpracy z cyfrowymi analizatorami obrazu (p. rozdz. 11.4).
1.2. Teoria mikroskopu
1.2.1. Powstawanie obrazu mikroskopowego
Bieg promieni świetlnych oraz sposób powstawania obrazu w mikroskopie optycznym został przedstawiony na ryc. 1.2. Jak wynika z układu optycznego mikroskopu, powstający obraz jest pozorny, powiększony i odwrócony.
1.2.2. Powiększenie całkowite mikroskopu
Oblicza się je, mnożąc powiększenie obiektywu przez powiększenie okularu i ewentualnie przez powiększenie pośredniego układu optycznego. W praktyce, całkowite powiększenia mikroskopów świetlnych mieszczą się w zakresie od 10 ´ do 1500 ´.
1.2.3. Zdolność rozdzielcza mikroskopu
Jakość obrazu oraz ilość informacji możliwych do uzyskania na jego podstawie uzależniona jest nie tylko od użytego powiększenia, ale przede wszystkim od tzw. zdolności rozdzielczej układu optycznego.
Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość dzieląca dwa punkty, które w obrazie mikroskopowym dostrzegane są oddzielnie. Wyraża się ją w jednostkach długości. Im mniejsza jest ta odległość, tym lepsza jest zdolność rozdzielcza układu optycznego i tym więcej informacji zawartych jest w obrazie mikroskopowym. W praktyce oznacza to również, że lepsza zdolność rozdzielcza umożliwia stosowanie wyższych powiększeń.
Zdolność rozdzielcza jest cechą wszystkich urządzeń tworzących obraz - a zatem nie tylko mikroskopu świetlnego, lecz również mikroskopów elektronowych, a także lunet, teleskopów, monitorów, itp., choć w przypadku tych ostatnich wyraża się ją inaczej.
Zdolność rozdzielczą mikroskopu określa wzór:
0,61 l
(1) d = ------ , gdzie:
A
l = długość fali tworzącej obraz (np. światła dla mikroskopu świetlnego
A = apertura numeryczna obiektywu mikroskopu, obliczana wg wzoru:
(2) A = n · sin a, gdzie:
n = współczynnik załamania fali tworzącej obraz charakteryzujący środowisko zawarte pomiędzy preparatem a soczewką obiektywu (w mikroskopach świetlnych jest to szkło lub powietrze);
a = kąt pomiędzy osią optyczną obiektywu a najbardziej skrajnym promieniem wpadającym do jego soczewki czołowej przy prawidłowym zogniskowaniu układu (ryc. 1.3).
Zarówno pierwszy jak i drugi czynnik wpływający na wartość apertury numerycznej obiektywu wyraża się liczbami, które mieszczą się w stosunkowo wąskim zakresie (n = 1 lub 1.56 przy zastosowaniu olejku immersyjnego; a = 75‑85° w obiektywach dużych powiększeń). Wartości apertury numerycznej wynoszą zatem dla najdoskonalszych obiektywów immersyjnych ok. 1,2‑1,4. Podstawiając do wzoru (1) odpowiednie dane liczbowe, czyli l = 0,45 mm (najniższa długość fali światła widzialnego - fioletowego) i A = 1,4, uzyskujemy wartość ok. 0,2 mm. Jest to najlepsza zdolność rozdzielcza, jaką teoretycznie można uzyskać w zwykłym mikroskopie świetlnym. W praktyce, przy przeciętnej długości fali światła widzialnego - 0,55 mm - wartość ta jest nieco wyższa i wynosi ok. 0,25 mm.
Istotną poprawę zdolności rozdzielczej mikroskopu można osiągnąć jedynie przez zmniejszenie długości fali świetlnej. Próby z zastosowaniem ultrafioletu (tzw. mikroskop ultrafioletowy - nie mylić z fluorescencyjnym) zostały szybko zaniechane, gdyż stosunkowo nieznaczną poprawę zdolności rozdzielczej uzyskano za cenę znacznego podwyższenia kosztów budowy mikroskopu (optyka kwarcowa) oraz utrudnienia warunków pracy (obraz widoczny jedynie na specjalnym ekranie fluorescencyjnym). Zdolność rozdzielczą mikroskopu świetlnego można również poprawić przez cyfrową obróbkę obrazu, wymagającą skomplikowanego oprzyrządowania komputerowego - uzyskana poprawa jest jednak także nieznaczna.
Istotny przełom w pracach nad polepszeniem zdolności rozdzielczej mikroskopu stanowiło zastąpienie fali świetlnej strumieniem elektronów, który posiada równocześnie własności fali o długości ok. 0,005 nm, czyli 100 000 razy mniejszej niż długość widzialnych fal świetlnych.
1.3. Specjalne odmiany mikroskopów świetlnych
1.3.1. Ciemne pole
Mikroskopowanie w tzw. ciemnym polu umożliwia dostrzeżenie w preparacie drobnych cząstek o wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego. Wykorzystuje się tu zjawisko dyfrakcji (ugięcia) promieni świetlnych padających na obiekt o bardzo małych rozmiarach. Przykładem takiego zjawiska jest świecenie drobnych cząstek kurzu, niedostrzegalnych w normalnych warunkach, jeżeli znajdą się one w smudze światła wpadającej np. przez szczelinę w zasłonie okiennej. Warunkiem dostrzeżenia cząstek pyłu jest spoglądanie na smugę światła z boku, tak, aby była widoczna na ciemnym tle.
Mikroskopowanie w ciemnym polu wymaga zastosowania specjalnego kondensora, w którym centralna część soczewki jest nieprzepuszczalna dla światła, a promienie świetlne przechodzą przez preparat jedynie pod bardzo ostrym kątem (ryc. 1.4). W tej sytuacji promienie przechodzące przez preparat nie wpadają do obiektywu, natomiast dostają się tam promienie ugięte i odbite przez znajdujące się w preparacie cząstki. Widać je jako drobne, świecące punkty na ciemnym tle. Metodę ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji mikroorganizmów obecnych w płynach ustrojowych.
1.3.2. Mikroskop kontrastowo-fazowy
Siatkówka oka reaguje na dwa spośród trzech parametrów fizycznych fali świetlnej: na długość fali (odbieraną jako barwa) oraz na jej amplitudę (odbieraną jako stopień jasności). Trzeci parametr fali świetlnej - faza - nie jest rejestrowany przez siatkówkę, chociaż ulega także zmianom przy przechodzeniu światła przez preparat mikroskopowy. Różne struktury obecne w preparacie powodują odmienne przesunięcie fazy fali świetlnej. Zjawisko to zostało wykorzystane w konstrukcji mikroskopu kontrastowo-fazowego. Zastosowano w nim specjalny układ optyczny, który przesunięcie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę jej amplitudy.
W obrębie kondensora mikroskopu kontrastowo-fazowego znajduje się pierścieniowa przesłona, która powoduje przekształcenie strumienia świetlnego emitowanego ze źródła światła w wiązkę promieni o kształcie pustego stożka. Przy przejściu tak uformowanej wiązki przez preparat, ten ostatni działa jak siatka dyfrakcyjna: część promieni świetlnych ulega ugięciu, natomiast reszta przechodzi prostoliniowo. Struktury preparatu powodują zróżnicowane ugięcie promieni i przesunięcie ich fazy. Obiektyw mikroskopu zawiera dodatkowy układ optyczny, który powoduje jednolite opóźnienie lub przyspieszenie fazy promieni biegnących prostoliniowo. W płaszczyźnie obrazu dochodzi do interferencji obu typów promieni, podczas której nałożenie na siebie fal świetlnych o zróżnicowanych fazach powoduje powstanie nowych fal, o zróżnicowanej amplitudzie (ryc. 1.5). W ten sposób struktury obecne w preparacie i powodujące różnego stopnia przesunięcie fazy fal świetlnych dostrzegane są w postaci skontrastowanej, czyli jako ciemniejsze i jaśniejsze.
Mikroskop kontrastowo-fazowy stosowany jest do badania komórek nie zabarwionych, z reguły żywych (np. hodowli komórkowych) oraz niekiedy do wzmocnienia ogólnego kontrastu w preparatach zabarwionych słabo lub wybiórczo (np. w metodach histochemicznych).
1.3.3. Mikroskop interferencyjny
Ten typ mikroskopu działa również na zasadzie przekształcania różnic faz fal świetlnych w różnice ich amplitudy, lecz odznacza się odmienną konstrukcją układu optycznego.
W obrębie kondensora znajduje się układ optyczny rozdzielający wiązkę światła na dwie składowe: promienie przechodzące bezpośrednio przez preparat i promienie przechodzące przez obszar przejrzysty, obok preparatu (tzw. wiązka odniesienia). Natomiast tubus zawiera układ działający odwrotnie: ponownie zespalający powyższe promienie w spójną wiązkę świetlną. Dochodzi zatem do interferencji pomiędzy wiązką odniesienia a promieniami ugiętymi przez struktury zawarte w preparacie. Z uwagi na fakt, że wiązka odniesienia posiada stałą charakterystykę, układ optyczny mikroskopu interferencyjnego nie tylko kontrastuje obraz, lecz także może służyć do analizy ilościowej suchej masy badanych struktur (z dokładnością do 10-13 g) oraz do określania grubości skrawków. Pozwala on również na rozszczepienie światła białego na barwne części widma i na optyczne "wybarwienie" struktur widocznych w obrazie mikroskopowym.
1.3.4. Optyka Nomarskiego
Znaczną popularność zyskały sobie specjalne systemy optyczne będące modyfikacjami mikroskopii kontrastowo-fazowej i interferencyjnej. Szczególnie użyteczny jest tzw. kontrast różnicowej interferencji Nomarskiego (DIC, ang. differential interference contrast), pozwalający na znaczne wzmocnienie kontrastu nie zabarwionych struktur komórkowych i uzyskanie ich plastycznego, nieomal trójwymiarowego obrazu.
1.3.5. Mikroskop polaryzacyjny
Mikroskop ten posiada wbudowane w układ optyczny dwa pryzmaty Nicola lub siatki polaryzacyjne, powodujące polaryzację światła (uporządkowanie chaotycznych drgań fal świetlnych w jednej płaszczyźnie). Jeden z pryzmatów (polaryzator) umieszczony jest pomiędzy źródłem światła a kondensorem, natomiast drugi (analizator) ponad obiektywem. Pozycja analizatora może być ustawiana dowolnie, poprzez jego obrót. Jeżeli płaszczyzny polaryzacji światła obu pryzmatów ustawione są równolegle, spolaryzowane promienie świetlne przechodzą swobodnie przez analizator i docierają do oka osoby mikroskopującej - pole widzenia jest wówczas jasne. Jeżeli natomiast płaszczyzna polaryzacji analizatora zostanie ustawiona pod kątem prostym do płaszczyzny polaryzatora, wówczas światło spolaryzowane przez polaryzator nie może przejść przez analizator i pole widzenia jest ciemne. Przy takim właśnie ustawieniu elementów polaryzujących światło (tzw. skrzyżowanie pryzmatów) mikroskop polaryzacyjny spełnia swoją rolę.
Przedmioty przejrzyste można podzielić na dwie grupy pod względem ich wpływu na polaryzację przechodzącego przez nie światła:
· obiekty izotropowe, czyli pojedynczo załamujące światło. Nie zmieniają one płaszczyzny polaryzacji, a zatem nie są widoczne w mikroskopie polaryzacyjnym przy skrzyżowanych pryzmatach;
· obiekty anizotropowe, czyli podwójnie załamujące światło, które zmieniają płaszczyznę polaryzacji części przechodzących promieni świetlnych. W tej sytuacji niektóre promienie uzyskują nową płaszczyznę polaryzacji, zgodną z płaszczyzną analizatora, i przechodzą przezeń. Obiekty takie są zatem widoczne jako jasne na ciemnym tle.
Do anizotropowych struktur obecnych w komórkach i tkankach należą przede wszystkim obiekty o wysoce uporządkowanym układzie wewnętrznym: włókna kolagenowe, zmineralizowana substancja międzykomórkowa tkanki kostnej, miofibrylle włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych oraz krystaliczne i parakrystaliczne wtręty wewnątrzkomórkowe. W diagnostyce histopatologicznej dużą rolę odgrywa wykrywanie za pomocą mikroskopu polaryzacyjnego złogów skrobiawiczych (amyloidu) wybarwionych czerwienią Kongo.
Omówione dotychczas specjalne odmiany mikroskopów można konstruować poprzez wymianę lub dodatkowe zamontowanie odpowiednich układów optycznych w normalnym mikroskopie świetlnym. Istnieją zatem przystawki ciemnego pola, kontrastowo-fazowe, interferencyjne i polaryzacyjne, przystosowane do uniwersalnych mikroskopów badawczych. Mikroskopy omawiane w kolejnych podrozdziałach wymagają całkowicie odmiennej konstrukcji - są zatem odrębnymi przyrządami.
...
carambola