Łoś Monika Poniedziałek, 12.15-16.00
Kowalczyk Katarzyna
Ryder Marta
Ćwiczenie 4
Hodowla w stałym podłożu
I. Wstęp teoretyczny
Solid state fermentation (hodowla w podłożu stałym) to metoda hodowli drobnoustrojów prowadzona na lub w pobliżu powierzchni wilgotnego, stałego substratu, stanowiącego pożywkę i miejsce bytowania mikroorganizmów.
Podłoże SSF składa się z odpowiednio przygotowanych składników naturalnych. Wielkość cząstek powinna wahać się w przedziale 1-8 mm. Jest to bardzo istotny parametr, ze względu na umożliwienie odpowiedniej wymiany ciepła. Podczas hodowli w stałym podłożu szczególnej uwagi wymagają takie parametry jak: temperatura i pH, napowietrzanie i mieszanie oraz aktywność wodna środowiska. Woda w hodowlach stałych tworzy filtr wokół cząsteczek, zapewniając drobnoustrojom kontakt z substancjami odżywczymi oraz fazą gazową. Podczas trwania procesu zawartość wody się zmienia na skutek aktywności metabolicznej drobnoustrojów oraz parowania. Zbyt niski poziom wilgotności powoduje ograniczenie wzrostu i stopnia pęcznienia substratu. Natomiast zbyt wysoki do zmniejszenia porowatości, przez co następuje ograniczenie dyfuzji tlenu i spadek tempa wymiany gazowej. W związku z tym powietrze doprowadzane do hodowli powinno być odpowiedniej wilgotności.
Hodowle SFF polecane są dla drobnoustrojów tlenowych nie wytwarzających śluzów oraz nie wymagających dużej zawartości wody w złożu - pleśni, promieniowców oraz niektórych gatunków drożdży i bakterii.
Hodowle w podłożu stałym wykazują szereg zalet:
v wzrost drobnoustrojów przebiega w warunkach zbliżonych do ich naturalnego środowiska,
v mała wilgotność zmniejsza niebezpieczeństwo zakażenia hodowli,
v możliwe zwiększenie wydajności otrzymanego produktu,
v możliwość stosowania form przetrwanych do szczepienia hodowli pozwala to na wyeliminowanie hodowli inokularnych w fermentorach,
v produkt może być ekstrahowany ze stałego podłoża natychmiast po hodowli lub może być przechowywany w zamrożonym stanie,
v pozostałość po hodowli może być użyta jako pasza dla zwierząt,
v odpady pofermentacyjne nie stanowią zanieczyszczenia środowiska.
Metoda ta nie jest wolna od wad, wśród których można wymienić:
v obróbka wstępna pewnych substratów może być niekiedy skomplikowana (np. odtłuszczanie),
v zraszanie w początkowej fazie fermentacji może powodować zakażenia,
v utrudnione powiększanie skali,
v utrudniona kontrola parametrów procesu: pH, temperatury, natlenienia, wilgotności.
II. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest poznanie metody hodowli drobnoustrojów w stałym podłożu oraz aparatury służącej do prowadzenia tego procesu.
III. Wykonanie ćwiczenia:
Jako materiału biologicznego do hodowli w podłożu stałym użyto szczepów bakterii Bacillus licheniformis. Fermentację prowadzono przez dwie doby w temperaturze 36oC.
Skład podłoża użytego w hodowli:
substraty stałe - 20g
otręby pszenne 17g
wytłoki sojowe 3g
roztwór soli – 10ml
Kolejne kolby różniły się zawartością wody dodanej dla zwiększenia wilgotności. Jej zawartość wynosiła 0, 5, 10 oraz 25 ml.
Następnie, w celu ekstrakcji enzymu, do kolb dodano po 100ml wody destylowanej i wstawiono je na wytrząsarkę na 30 minut. Po ekstrakcji odwirowano części stałe zawiesiny, pobrano 0,5 ml supernatantu i rozcieńczono go odpowiednio(100x oraz 200x) w celu oznaczenia aktywności α-amylazy.
Aktywność α-amylazy oznaczano metodą Fishera-Steina:
Do 0,5ml rozcieńczonego enzymu dodano 0,5ml 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie dodawano 1ml kwasu 3,5-dinitrosalicylowego, w celu zatrzymania reakcji. Mieszaninę inkubowano przez 5 minut we wrzącej łaźni, wystudzono i dodano 8 ml wody destylowanej. Próbę kontrolną wykonano w taki sam sposób stosując wodę destylowaną zamiast roztworu enzymu. Absorbancję mierzono na spektrofotokolorymetrze przy długości fali 540nm.
Aktywność obliczano ze wzoru:
,
gdzie:
ΔA - różnica absorbancji,
R – rozcieńczenie,
N = 4,
100 – objętość ekstrahenta,
1000 – przeliczenie na μmol,
3 – czas reakcji,
m2 – masa złoża po fermentacji,
360 – masa molowa maltozy.
Tak obliczona aktywność wyrażona jest w międzynarodowej jednostce aktywności – jest to taka ilość enzymu, która uwalnia z substratu 1 μmol produktu na minutę. Wyraża się ją na gram wilgotnego złoża.
Nasza grupa wykonywała pomiary dla kolby nie zawierającej dodatkowej wody. Uzyskane pomiary absorbancji:
rozcieńczenie 100-krotne: 0,7
rozcieńczenie 200-krotne: 0,32
Przykładowe obliczenie:
Zestawienie wyników:
Ilość wody [ml]
Wilgotność [%]
pH
m1 [g]
m2[g]
m1-m2 [g]
Aktywności α-amylazy
[J/1g wilgotnego złoża]
Średnia aktywność α-amylazy
0
33
7,54
30
28,6
1,4
907
829
479
635
790
5
43
7,46
35
32,9
2,1
1180
1214
719
1012
1135
10
50
7,38
40
37,5
2,5
533
810
494
711
25
64
6,94
55
51,5
3,5
366
445
234
126
348
Wykres zależności aktywności α-amylazy od wilgotności złoża:
IV. Wnioski
Z wykonanych przez nas oznaczeń wynika, że największa aktywność α-amylazy przypada na objętość wody dodanej do złoża wynoszącą 5ml, co odpowiada wilgotności równej 43%. Możemy zaobserwować spadek pH wraz ze wzrostem wilgotności. pH w naszych hodowlach wahało się w zakresie od 7,54 do 6,94. Wzrost wilgotności związany był również ze wzrostem ubytku masy hodowli. Dla hodowli o wilgotności 33% wynosił on 1,4 g, natomiast dla hodowli o zawartości wilgoci 64% był on równy już 3,5g.
liliw