skrypt_enzymy.pdf

Słodki świat enzymów

Takao Ishikawa, Anna Karnkowska,

Joanna Lilpop, Jakub Urbański

Opracowanie merytoryczne treści zestawu:

Takao Ishikawa, Anna Karnkowska, Joanna Lilpop, Jakub Urbański

Ilustracje:

Anna Lea Chojnacka

Korekta:

Michał Mlącki

Zestaw opracowany w ramach projektu „Science of Modern Biology –

Exploratory Resources for Biology Teachers and Students” inansowanego

przez UNESCO.

Autorzy pragną serdecznie podziękować wszystkim osobom, które

przyczyniły się do powstania zestawu, w szczególności współpracownikom

Szkoły Festiwalu Nauki, Fundacji BioEdukacji oraz instytucjom

założycielskim Szkoły Festiwalu Nauki: Międzynarodowemu Instytutowi

Biologii Molekularnej i Komórkowej, Instytutowi Biochemii i Bioizyki PAN,

Instytutowi Biologii Doświadczalnej PAN, Szkole Głównej Gospodarstwa

Wiejskiego.

Osobne podziękowania należą się dyrektorowi MIBMiK, panu Profesorowi

Jackowi Kuźnickiemu.

Część pomysłów i procedur zamieszczonych w zestawie pochodzi od National

Centre for Biotechnology Education w Reading (www.ncbe.reading.ac.uk),

którym serdecznie dziękujemy za nieocenioną pomoc i wsparcie.

Niniejsze materiały podlegają licencji Creative Commons:

Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne-Bez utworów zależnych 2.5 Polska.

1 4 3

Niniejsze materiały wolno kopiować i rozpowszechniać wyłącznie niekomercyjnie w celach edukacyjnych,

pod warunkiem umieszczenia na kopiach logo Funacji BioEdukacji i Szkoły Festiwalu Nauki oraz informacji

o autorach. Nie zezwala się na zmiany ani przekształcenia niniejszego skryptu. W przypadku innych

zastosowań lub zmian materiałów niezbędna jest zgoda Fundacji BioEdukacji (www.bioedukacja.org.pl).

Szkoła Festiwalu Nauki

Enzymy

Enzymy pełnią w komórkach wszystkich organizmów żywych niezwykle istotną funkcję

- działają jako biokatalizatory . Pośredniczą we wszystkich szlakach anabolicznych i katabo-

licznych, obniżając energię aktywacji reakcji biochemicznych. Większość znanych enzymów

jest białkami, lecz odkryto również cząsteczki RNA wykazujące aktywność katalityczną,

tak zwane rybozymy.

Jako katalizator enzym nie zmienia stanu równowagi reakcji chemicznej, tylko przyspie-

sza jego osiągnięcie. Reakcja przemiany substratu S w produkt P przechodzi przez stan

przejściowy. Wartość energii swobodnej stanu przejściowego jest zdecydowanie wyższa niż

energia swobodna substratu i produktu. W warunkach izjologicznych energia wewnętrz-

na układu jest na tyle niska, że nie wystarcza na pokonanie progu energetycznego stanu

przejścia. Enzym, jako katalizator obniża znacznie energię aktywacji – energię swobodną

Gibbsa oznaczaną jako ∆G. Enzymy mają niezwykle dużą siłę katalityczną - w obecności

enzymu reakcja zachodzi o kilka rzędów wielkości szybciej. Anhydraza węglanowa kata-

lizująca reakcję przeniesienia dwutlenku węgla z tkanek do krwi przyspiesza reakcję 10 7

razy!!! Cząsteczka tego enzymu jest w stanie uwodnić 10 5 cząsteczek dwutlenku węgla na

sekundę!!!

Budowa enzymów

Wiele enzymów białkowych ma bardzo złożoną strukturę. Oprócz części białkowej

- apoenzymu zbudowanego z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych, występuje

w nich również niebiałkowa, trwale związana z cząsteczką enzymu grupa prostetyczna

(np. jon metalu) lub nietrwale związany koenzym (np. witamina). Cały tego typu kompleks

nazywany jest holoenzymem. Centrum aktywne enzymu, a więc rejon odpowiedzialny za

katalizowanie reakcji stanowi z reguły niewielki rejon cząsteczki enzymu.

Specyiczność substratowa

Niezwykle istotną właściwością enzymów jest ich specyiczność substratowa . Już pod

koniec XIX wieku, dla opisania specyiczności enzymów Emil Fischer zaproponował model

zamka i klucza. Zgodnie z założeniami tego modelu trójwymiarowa struktura substratu

odpowiada dokładnie trójwymiarowej strukturze wnętrza centrum aktywnego enzymu.

W późniejszych latach wykazano jednak, że tego typu, niezwykle precyzyjne dopasowa-

nie obydwu cząsteczek uniemożliwiałoby wydajne obniżenie energii aktywacji. W związku

z tym zaproponowano model indukcyjnego dopasowania, zgodnie z którym struktury

trójwymiarowe centrum aktywnego enzymu oraz substratu wykazują powinowactwo, nie

są jednak idealnie dopasowane.

Podczas łączenia się cząsteczki substratu (lub cząsteczek substratów) z centrum aktyw-

nym dochodzi do nieznacznych zmian konformacji cząsteczek, w efekcie czego powstają

naprężenia wiązań w obrębie cząsteczki, przez co obniża się energia reakcji katalitycznej.

Często porównuje się dopasowywanie struktury substratu do centrum aktywnego do

dopasowywania się kształtu rękawiczki do dłoni.

Enzymy różnią się stopniem specyiczności. Jeżeli rozpatrzymy specyiczność rozkłada-

jących wiązania peptydowe enzymów proteolitycznych zauważymy, że mimo iż enzymy

te przeprowadzają dokładnie ten sam typ reakcji, wykorzystują różne substraty. Trypsyna

hydrolizuje tylko wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszty lizyny lub argininy.

Trombina, jeden z enzymów odpowiedzialnych za krzepnięcie krwi, hydrolizuje tylko wiąza-

nia między resztami argniny i glicyny, podczas gdy bakteryjna subtilopeptydaza hydrolizuje

wiązania peptydowe bez względu na to, między jakimi aminokwasami występują.

Ryc. 1. Schemat

indukcyjnego dopasowania

Regulacja reakcji enzymatycznych

Oprócz miejsca wiązania substratu – centrum aktywnego – wiele enzymów ma również

centrum allosteryczne, czyli miejsce regulatorowe, do którego wiązać mogą się cząsteczki

www.sfn.edu.pl

Słodki świat enzymów

inhibitorów lub aktywatorów , odpowiednio hamujących, bądź indukujących aktywność

enzymu. W enzymach wchodzących w skład złożonych szlaków metabolicznych inhibitorami,

na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, bardzo często są produkty szlaku metabolicz-

nego – nadmiar produktu danego szlaku, powoduje zahamowanie enzymów tego szlaku.

Z reguły ostateczny produkt szlaku jest inhibitorem dla enzymu katalizującego pierwszy

etap danego szlaku – dzięki temu minimalizowana jest utrata energii na syntezę pośrednich

produktów szlaku. Przykładem może być tutaj szlak syntezy izoleucyny, którego ostateczny

produkt - izoleuzyna działa jako inhibitor pierwszego enzymu szlaku – dehydratazy treoni-

nowej. Spadek stężenia izoleucyny powoduje ponowne uruchomienie reakcji.

Inhibicja enzymu może mieć charakter kompetycyjny . O tego typu oddziaływaniu

mówimy wówczas, gdy inhibitor oddziałuje z centrum aktywnym enzymu i konkuruje z

substratem. Cząsteczka inhibitora wykazuje podobieństwo struktury przestrzennej do

struktury przestrzennej substratu, wzajemny stosunek stężeń obydwu cząsteczek wpływa

na ogólne tempo przeprowadzania reakcji.

Inhibitory mogą wiązać się z cząsteczkami enzymów nieodwracalnie, prowadząc do

całkowitego ich unieczynnienia. W ten sposób działa wiele antybiotyków, między innymi

antybiotyki betalaktamowe, takie jak penicylina hamująca biosyntezę peptydoglikanu

wchodzącego w skład ściany komórkowej bakterii.

Właściwości środowiska mają wpływ na aktywność enzymów

Aktywność enzymów zależy od parametrów środowiska, takich jak temperatura, pH i

osmolarność, czyli stężenie soli. Każdy z enzymów ma optymalną temperaturę działania – dla

większości enzymów mieści się ona w granicach 35-45 o C. Wyższe temperatury powodują z

reguły trwałe unieczynnienie enzymu poprzez denaturację jego struktury – wyjątkiem są

tu enzymy niektórych archeonów i bakterii zasiedlających środowiska ekstremalne, których

enzymy osiągają optymalną aktywność w temperaturach 80-90 o . Stężenie soli i pH są na

ogół stałe w komórkach, bądź ich określonych przedziałach. Większość enzymów działa

optymalnie w pH bliskim obojętnego, chociaż na przykład niektóre enzymy trawienne

wydzielane w soku żołądkowym, lub enzymy obecne w lizosomach katalizują reakcje przy

silnie kwasowym pH rzędu 2-3.

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Kinetykę reakcji enzymatycznych katalizowanych przez enzymy nieallosteryczne opisuje

model Michaelisa-Menten zaproponowany w 1913 roku przez Leonor Michaelis i Maud

Menten. Model ten opiera się na założeniu, że niezbędnym etapem pośrednim procesu

katalitycznego jest powstanie kompleksu enzym-substrat:

Równanie Michaelisa-Menten przedstawia się następująco:

[S]

V = Vmax ------------

[S]+Km

gdzie:

V – prędkość katalizowanej reakcji

Vmax – maksymalna prędkość katalizowanej reakcji (w warunkach optymal

nych)

[S] – stężenie substratu

Km – stała Michaelisa - oznacza stały dla danego enzymu stosunek szybkości

reakcji (k2+k3)/k1 (patrz Ryc.2.)

Przy bardzo dużych stężeniach substratu Km można pominąć, co pozwala na uproszcze-

nie równania do formy V=Vmax. W takich warunkach wszystkie cząsteczki enzymu będą

wysycone substratem i będą pracować z pełną wydajnością.

Szkoła Festiwalu Nauki

Ryc. 2. Schemat reakcji

enzymatycznej

Jeżeli stężenie substratu będzie równe Km, prędkość reakcji będzie równa połowie

prędkości maksymalnej zgodnie z równaniem:

[S]

V = Vmax ------------

[S]+[S]

A więc stała Michaelisa wyznacza stężenie substratu, przy którym prędkość reakcji jest

równa połowie prędkości maksymalnej.

Zmieniając stężenie substratu przy zachowaniu pozostałych warunków reakcji można

wyznaczyć eksperymentalnie Vmax i Km.

Z aktywnością enzymów związane jest pojęcie liczby obrotów enzymu – jest to liczba

reakcji, jaką cząsteczka enzymu jest w stanie katalizować w ciągu jednej sekundy, przy

maksymalnej prędkości.

Podział enzymów

Enzymy dzieli się na sześć klas. Podstawą klasyikacji jest rodzaj katalizowanej reakcji

i rodzaj substratów.

Oksydoreduktazy – katalizują reakcje typu redoks (np. peroksydaza katalizująca rozkład

wody utlenionej).

Transferazy - katalizują przenoszenie grup funkcyjnych między cząsteczkami lub w

obrębie jednej cząsteczki (np. metylaza przenosząca grupę metylową –CH 3 )

Hydrolazy – katalizują reakcje rozpadu z udziałem wody – hydrolizę (np. amylaza hy-

drolizująca wiązania w cząsteczkach skrobii).

Liazy – katalizują reakcje rozpadu bez udziału wody (np. dekarboksylaza pirogronianowa

katalizująca rozpad pirogronianu do dwutlenku węgla i aldehydu octowego).

Ligazy – katalizują reakcje syntezy (np. ligaza faga T4 – katalizuje łączenie cząsteczek

dwuniciowego DNA)

Izomerazy – katalizują reakcje izomeryzacji (np. izomeraza fosfofruktozy, przekształca

fosfofruktozę w fosfoglukozę).

Wedle nomenklatury ustalonej przez Komisję Enzymów, każdemu scharakteryzowanemu

enzymowi nadaje się specyiczny numer katalogujący go do odpowiedniej klasy. Litery E.C.

umieszczone przed numerem enzymu oznaczają skrót Enzyme Catalogue. Na przykład

omawiane w tym zestawie doświadczalnym hydrolazy mają numer E.C. 3.2.1.N, gdzie N

jest numerem danego enzymu.

Enzymy w biotechnologii i przemyśle

Na długo zanim uczonym udało się dociec jakie cząsteczki biologiczne odpowiedzialne

są za katalizę, nie mówiąc już o wyizolowaniu ich i oczyszczeniu, ludzie wykorzystywali

www.sfn.edu.pl

Słodki świat enzymów

w życiu codziennym enzymy naturalnego pochodzenia. Wspomnieć wystarczy o produkcji

alkoholu (dehydrogenaza alkoholowa z drożdży), czy serów podpuszczkowych (podpuszczka

z żołądków bydlęcych).

Jednak dzięki dynamicznemu rozwojowi biotechnologii, w ciągu ostatnich kilkudziesięciu

lat naukowcy opanowali nie tylko metody izolacji i oczyszczania białek enzymatycznych,

ale również ich modyikowania i otrzymywania na skalę przemysłową.

Na masową skalę enzymy otrzymywane są z bakterii, po uprzednim wprowadzeniu genu

kodującego pożądany enzym do ich komórek. Hodowla bakterii jest prowadzona w tzw.

chemostacie, w którym panują stałe warunki hodowli umożliwiające ciągłe otrzymywanie

bakterii o takich samych własnościach. Zazwyczaj wprowadzany do bakterii gen kodujący

enzym jest dodatkowo opatrzony w odpowiedni promotor, znacznie zwiększający ekspre-

sję tego genu, co umożliwia nadprodukcję pożądanego enzymu. Jest to niezwykle istotne,

ponieważ dzięki takiemu zabiegowi produkowany enzym występuje w bardzo dużej prze-

wadze liczbowej w stosunku do innych białek występujących w komórce bakterii.

Każde laboratorium genetyczne korzysta z enzymów otrzymywanych na skalę prze-

mysłową – począwszy od wirusowych enzymów służących do syntezy RNA i DNA, przez

bakteryjne enzymy restrykcyjne, fosfatazy sklonowane z genomu krewetek i innych orga-

nizmów morskich, aż po zmodyikowaną peroksydazę pochodzącą z chrzanu.

Oczywiście rekombinowane enzymy wykorzystuje się nie tylko w laboratoriach – stykamy

się z nimi na codzień: w skład proszków do prania wchodzą zmodyikowane bakteryjne

enzymy proteolityczne i lipolityczne, w przemyśle serowarskim stosuje się produkowaną

przez bakterie podpuszczkę cielęcą (w wielu krajach, w tym Polsce znakomita większość

serów podpuszczkowych produkowana jest przy użyciu takiej podpuszczki), a diabetycy

korzystają z produkowanej przez bakterie ludzkiej insuliny. To zaledwie kilka przykładów,

kolejne można by mnożyć niemal w nieskończoność... Enzymy są wokół nas i nie jesteśmy

świadomi, jak wiele produktów, których używamy na co dzień, zawiera je lub powstało

właśnie dzięki nim.

W proponowanych doświadczeniach przedstawiamy trzy enzymy z klasy hydrolaz, zaan-

gażowane w metabolizm cukrowców – amylazę, laktazę i izomerazę. Są one podstawowymi

enzymami trawiennymi w przewodach pokarmowych ludzi, ale także ich odpowiedniki

przemysłowe są istotnymi narzędziami w przemyśle spożywczym.

WĘGLOWODANY

Węglowodany to jedna z czterech najważniejszych klas cząsteczek biologicznych. Wę-

glowodany, zwane też cukrowcami są związkami organicznymi składającymi się z węgla,

wodoru i tlenu. Cukrowce są to wielowodorotlenowe aldehydy bądź ketony oraz ich po-

chodne. Występują jako cukry proste oraz ich polimery: oligosacharydy i polisacharydy.

W wielu strukturach komórkowych węglowodany występują jako fragmenty cukrowe o

różnej budowie i wielkości, często w połączeniu z białkami (glikoproteiny) i lipidami (gli-

kolipidy).

Cukrowce stanowią materiał zapasowy i główne źródło energii w komórkach istot żywych,

wchodzą w skład szkieletu struktury RNA i DNA, jako elementy strukturalne budują ściany

komórkowe bakterii, roślin, grzybów oraz szkielety zewnętrzne stawonogów.

Rola cukrów w organizmie człowieka

Najważniejszą funkcją węglowodanów w organizmie człowieka jest dostarczanie ener-

gii. Po strawieniu i wchłonięciu, węglowodany w postaci glukozy są rozprowadzane przy

udziale krwi do tkanek. Tam zachodzi oddychanie, czyli utlenienie glukozy do CO 2 i H 2 O

z wytworzeniem energii, którą organizm wykorzystuje zgodnie z aktualnymi potrzebami

energetycznymi.

Niezmiernie ważne jest utrzymywanie stałego poziomu glukozy we krwi, gdyż istnieje

ciągła potrzeba zaopatrywania w glukozę wszystkich komórek ciała, zwłaszcza czerwonych

krwinek i mózgu, które nie mogą korzystać z innych źródeł energii. Poziom glukozy we krwi

ma także ścisły związek z metabolizmem tłuszczów i białek, gdyż glukoza wykorzystywana

jest również do syntezy struktur komórkowych (np. podczas ciąży i w okresie wzrostu) oraz

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: