Zwierzęce in vitro
Wykład 1
Hodowla komórek i tkanek – metoda umożliwiająca utrzymanie poza organizmem żywym komórek, fragmentów tkanek i narządów. Do 24 godzin trwa inkubacja a potem hodowla.
Eksplantant – wyosobniony fragment tkanki lub narządu.
Hodowle jednowarstwowe – pojedyncza warstwa komórek rosnących na powierzchni.
Hodowla w zawiesinie – hodowla w której rozmnażają się komórki zawieszone w pożywce.
Hodowla pierwotna – hodowla wyprowadzona z komórek, tkanek lub narządów pobranych bezpośrednio z organizmu. Zachowuje ona swą nazwę do czasu pierwszego pasażu czyli przeniesienia komórek z jednego naczynia do drugiego. Następnie staje się linią komórkową.
Hodowle narządów – Hodowle całych narządów lub ich fragmentów. Zaletami są zachowanie interakcji elementów komórkowych, zróżnicowanie tkanek nie zmienia się, warunki są zbliżone do sytuacji in vivo. Wadami natomiast jest utrudniony dostęp tlenu i substancji odżywczych do wnętrza tkanek.
Hodowle na mikronośnikach – hodowla komórek na kulkach dekstranowych, żelatynowych, szklanych lub plastikowych. Zaleta to duża powierzchnia wzrostu w małej objętości pożywki.
Hodowle przestrzenne – hodowle, w których odtworzono wzajemne przestrzenne kontakty między komórkami oraz charakterystyczny układ poszczególnych typów komórek. Należa tu :
· Hodowle narządów
· Agregaty i sferoidy
· Kokultury organotypowe
· Hodowle na sztucznych naczyniach włosowatych
· Modele tkankowe i narządowe
Linia komórkowa powstaje z hodowli pierwotnej po przepasażowaniu komórek.
Ustalona linia komórkowa – linię komórkową uznajemy za ustalona po wykazaniu, że można ją pasażować przez czas nieograniczony ( np. hodowla ludzkich fibroblastów musi być przeszczepiona co najmniej 70 razy w trzydniowych odstępach by można by je uznać za ustaloną).
Transformacja komórek – zmiany wywołane w komórkach przez wprowadzenie nowego materiału genetycznego.
ü pełna kontrola hodowli ( temperatura, pH, ciśnienie osmotyczne, tlen, dwutlenek węgla
ü możliwość bezpośredniego wpływu na konkretne komórki
ü możliwość badania funkcji i reaktywności poszczególnych typów komórek oraz badania interakcji komórkowych
ü zwiększenie powtarzalności wyników
ü niskie koszty badania in virto w stosunku do in vivo
ü nie odtwarzają w pełni sytuacji in vivo
ü konieczność utrzymania ścisłej aseptyki
ü niestabilność niektórych linii komórkowych
ü odróżnicowanie komórek w trakcie hodowli
ü starzenie się komórek w czasie hodowli
ü niekorzystny lub nie w pełni kontrolowany wpływ niektórych składników pożywki na hodowane komórki
Do hodowli wykorzystuje się często butle typu Spiner flash a operacje prowadzi się w komorze laminarnej wertylaknej lub horyzontalnej.
1. Sole nieorganiczne
ü Właściwe ciśnienie osmotyczne
ü Regulacja potencjału błonowego komórki
ü Kofaktor enzymów
ü Niezbędne do wiązania się komórek z białkami macierzy komórkowej
2. Węglowodany
ü Główne źródło energii (glukoza)
3. Aminokwasy
ü Niezbędne do poliferacji i różnicowania komórek
4. Białka i peptydy
ü Zastępują białka w surowicy np. fibronektyna, transferyna
ü Nośniki kwasów tłuszczowych, żelaza
ü Umożliwiają przytwierdzenie się komórek do powierzchni naczyń hodowlanych lub mikronośników
5. witaminy
ü niezbędne do wzrostu i różnicowania
ü prekursory
ü kofaktory
6. pierwiastki śladowe
ü miedź, cynk, selen
ü kofaktory enzymów
ü selen – detoksykator, usuwa wolne rodniki tlenowe
7. hormony i czynniki wzrostu
ü insulina, hydrokortyzon, IGF, FGF, TGF
ü ułatwiają wzrost i różnicowanie komórek
8. Indykatory i wskaźniki pH
ü czerwień fenolowa
9. Antybiotyki
ü Likwidują zanieczyszczenia bakteryjne i grzybiczne
10. surowica
ü ZALETY
ü Pobudza przeżywalność i wzrost komórek (jedynie komórki unieśmiertelnione transformowane nie wymagają surowicy) buforuje pożywkę i neutralizuje efekty toksyczne np. endotoksyn i enzymów proteolitycznych
ü ZAWIERA
ü Czynniki wzrostu ( FGF, EGF, DDGF, IGF, TGF)
ü Hormony np.. insulina i glikokortykoidy
ü Albuminy (białka nośnikowe, detoksykujace i buforujące)
ü Transferyna (czerpie żelazo)
ü Czynniki adhezyjne (fibronektyna, laminina, fetuina, halogeny, składowe związków macierzy)
ü Antyproteazy np. globuliny, alfa antytrypsynowe, alfa2 makroglobuliny
Wszystkie te związki występują w koncentracji fizjologicznej i w fizjologicznych proporcjach. Najczęściej używa się surowicy płodowej cielęcej (FCS), cielęcej, bydlęcej i ludzkiej w koncentracji 5-20%.
ü WADY
ü Może być źródłem wirusów lub mykoplazm
ü Nadmiar białek w trakcie produkcji biofarmaceutyków
ü Brak standaryzacji, poszczególne serie surowic różnią się między sobą
ü Obecność swoistych przeciwciał np. dla hormonów lub antygenów wirusowych
ü Surowica utrudnia standaryzację procedur doświadczalnych i produkcyjnych
ü DLATEGO
ü Wprowadza się użycie pożywki typu SFM zaprojektowanej dla konkretnych typów komórek lub linii komórkowych
ü Używa się substytutów surowicy np. albuminy bydlęcej BSA, alfa globulin, CPSR firmy Sigma
ü I/lub używa się surowic selektywnych np. w pożywkach do preinkubacji przy braku w inkubacjach lub hodowlach właściwych
Zanieczyszczenia bakteriologiczne.
Penicylina (G+)
Streptomycyna (G-)
Antybiotyki bakteriobójcze (bakteriostatyczne o szerokim spektrum działania np. gentamycyna)
Antybiotyki grzybobójcze typu nystatyna lub enfoteracyn
Dodatek związków przeciw pierwotniakom np. metronidaza.
ZA
ü trzymanie w ryzach zanieczyszczeń mikrobiologicznych
PRZECIW
ü sprzyjanie wytwarzania form antybiotykoopornych
ü efekt antymetaboliczny
ü zachęta do nieprzestrzegania aseptyki w laboratorium
CO2
Ø Razem z NaHCO3 utrzymuje pH pożywki
Ø 5% à 10% pH spada z 7,4 do 7,2
Ø wytwarzany także endogennie
O2
Ø inny niż przyżyciowo sposób dostarczania tlenu komórkom (brak pośrednictwa hemoglobiny)
Ø ograniczone rozpuszczanie tlenu w pożywce w temp 37 stopni C
Ø wpływ koncentracji komórek w hodowli na zużycie tlenu przy wzroście à zwiększone wytwarzanie kwasu mlekowego i dwutlenku węgla, unieruchomienie metabolizmu beztlenowego, media zmieniają kolor na pomarańczowy (obecność grupy fenolowej w pożywce )
Optimum temperatury zależy od temperatury ciała zwierzęcia od którego pobrano tkanki oraz od rodzaju hodowanej tkanki (np. temperatura skóry niższa niż innych tkanek).
Hodowla jednowarstwowa – pojedyncza warstwa komórek rosnących na powierzchni stałej. Można w ten sposób hodować komórki wywodzące się z tkanek twardych, np. jajniki, nerki, komórki nabłonkowe, endometrialne, fibroblasty, komórki układu nerwowego. Wadą jest możliwość odróżnicowania komórek.
Tworzy się wiązanie wodorowe i Van der Walsa, desmosomy i złącza szczelinowe między komórkami.
W trakcie hodowli komórki przyjmują kształt zbliżony do komórek epitelialnych lub fibroblastów. Po wytworzeniu ciągłej warstwy komórek dochodzi do tzw. hamowania kontaktowego dalszego wzrostu.
Hamowanie kontaktowe następuje w fazie Go. Komórki transformowane w mniejszym stopniu także wytwarzają znaczne ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej dalej tworząc następne warstwy.
Enzymy:
Ø rozbija wiązania peptydowe utworzone przez lizynę albo argininę głównie w fibronektynie ECM
Ø po ok. 20 min. Trawienie w temp 37 stopni C , spadek aktywności enzymu w wyniku jego samostrawienia
Ø dłuższy kontakt komórek z enzymem powoduje spadek żywotności komórek lub uszkodzenie ich struktur powierzchniowych np. receptorów błonowych
Ø otrzymywane najczęściej z trzustek bydlęcych i świńskich
Ø zazwyczaj zanieczyszczona jest chymotrypsyna, elastazą, amylazą, DNAazą, RNAazą
Używa się również kolagenaz różnych typów (m.in. do trawienia tkanki łącznej), pronaza (aby uzyskać fibroblasty) elastazy, DNAazy (trawienie DNA) oraz czynników chelatujących np. EDTA wiążących jony Ca i Mg i podtrzymujących strukturę ECM.
Powierzchnie naczyń hodowlanych dla kultur jednowarstwowych są często modyfikowane wytworzyć na ich powierzchni ładunki ujemne głównie grupy karboksylowe ułatwiające przyklejanie się komórek.
Naczynia pokrywa się też białkami macierzy pozakomórkowej naturalnej ( kolageniny, laminy, fibronektyna, proteoglikany) lub sztucznej np. matriglem.
Kolagen – trimer, tworzy podwójną helisę
Fibronektyna – podwójny łańcuch z mostkami disiarczkowymi
Niska gęstość hodowli sprzyja poliferacji ( podobnie większość czynników wzrostu) a wysoka przeciwnie ( hamowanie kontaktowe). Duża gęstość sprzyja też różnicowaniu komórek ( interakcja komórka-komórka, komórka-macierz). Różnicowanie nasilają też niektóre składniki pożywki np. hydrokortyzon lub retinoidy.
HODOWLA W ZAWIESINIE
Wzrost niezależny od przyczepienia się do podłoża, warunkiem utrzymanie pożywki w ruchu.
Komórki krwiotwórcze, niektóre linie komórkowe, niektóre komórki nowotworowe np. białaczkowe. Media wymagają obniżenia zawartości Ca by zapobiec tworzeniu się agregatów i przyklejaniu komórek do ścian naczyń hodowlanych.
Hodowle w agarze
Hodowle w bioreaktorze
Hodowle przestrzenne – to takie w których odtworzono naturalne przestrzenne kontakty miedzy komórkami oraz charakterystyczny układ poszczególnych typów komórek. Należą do nich:
Ø hodowle narządów
Ø agregaty i sferoidy
Ø kokultury organotypowe
Ø hodowle na sztucznych naczyniach włosowatych
Ø...
Petroc