Instytut Biochemii Technicznej
I. Biotransformacja
Transformacja – przekształcenie, przeobrażenie.
Biotransformacja to jednoetapowe (rzadziej dwuetapowe) przekształcenie chemiczne egzogennych związków organicznych w strukturalnie im podobne produkty dokonywane przez żywą komórkę.
1. Idea biotransformacji jako bioprocesu
Produkty biotransformacji bardzo często nie mają żadnego znaczenia dla komórki, a niekiedy wręcz mogą okazać się dla niej toksyczne (np. produkty biotransformacji steroidów). Biotransformacja nie jest celem działania komórki; zachodzi ona często jako proces niezależny od jej funkcji życiowych.
Biotechnolog wykorzystuje naturalny aparat enzymatyczny komórki, podstawia jej pewne związki organiczne i oczekuje, że zostaną one przekształcone zgodnie z jego przewidywaniami.
Ważne jest skojarzenie:
Drobnoustrój Þ enzym Þ możliwa biotransformacja
Można uznać, że w wielu przypadkach „komórka nawet nie zdaje sobie sprawy z tego, że zostaje oszukana i wykorzystana do przekształcenia podsuniętego jej związku organicznego”.
Przykładem może być reakcja kondensacji. Podstawia się komórce egzogenny związek a komórka nieświadomie kondensuje go z naturalnym metabolitem występującym w komórce np. acetylo~SCoA. Tym egzogennym substratem może być np. anilina:
Biotransformację mogą prowadzić:
1. Komórki wegetatywne (w fazie wzrostu)
2. Komórki wegetatywne (w fazie spoczynku)
3. Komórki drobnoustrojów immobilizowanych
4. Komórki drobnoustrojów wysuszonych
5. Formy przetrwane drobnoustrojów
Biotransformacja jest procesem (reakcją) wysoce specyficzną pod względem: kierunku, swoistości substratowej oraz stereospecyficzności.
Stereospecyficzność. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, która przekształca bursztynian do fumaranu (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje.
Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest α‑glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α‑D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β‑D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei subtilizyna (serynowa proteinaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów N‑acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu.
Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi. Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP–1-glukozę w UDP-1-galaktozę.
Regioselektywność
Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego specyficzności kierunkowej.
Na rys. 1. przedstawiono przykłady reakcji regioselektywnej hydrolizy estrów karboksylowych katalizowanych przez subtilizynę. Estry dibenzylowe kwasu asparaginowego i glutaminowego są hydrolizowane przy pierwszym atomie węgla. Natomiast estry etylowe kwasu cytrynowego i 1,2,3‑trikarboksylopropanu są hydrolizowane przy środkowym atomie węgla. Okazało się, że inne możliwe regioizomeryczne estry nie były wykrywane wśród produktów hydrolizy.
Regioselektywna hydroliza estrów katalizowana przez subtilizynę
Monooksygenazy wielu mikroorganizmów mogą regioselektywnie i stereospecyficznie hydroksylować steroidy. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji a lub b oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy od użytego szczepu oraz w pewnym stopniu od budowy cząsteczki substratu. Bakterie B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji a i b (rys. 11.). Monooksygenazy szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku pozycjach: 15 a i b, 6 b oraz 11a.
2. Reakcje wykorzystywane w biotransformacji
Dehydrogenazy sprzężone z NAD utleniające grupę –OH (EC.1.1.1.).
Utlenienie grupy hydroksylowej do ketonowej przez 17-b-dehydrogenazę estradiolową (EC.1.1.1.62) sprzężoną z NAD.
Oksydazy (EC.1.1.3.) utleniające grupę –OH.
Odwodornienie
Duże znaczenie praktyczne w produkcji związków steroidowych ma reakcja odwodornienia w pozycji D1 pierścienia A. Do przekształcenia kortyzonu w prednizon (a także innych analogów kortykosteroidowych) można zastosować bakterie B.lentus lub B.sphaericus (rys.6.10.). Dzięki działaniu D1-dehydrogenazy 3-oxosteroidowej (EC.1.3.99.4.) w sposób wybiórczy ulega odwodornieniu wyłącznie pierścień A, a ilość reakcji ubocznych jest niewielka w porównaniu do pojawiających się podczas stosowania do tego celu innych drobnoustrojów.
Rys. 6.10. D1 odwodornienie kortyzonu przez B.lentus lub B.sphaericus
Redukcja
(Nie mylić z dehydrogenazą bursztynianową sprzężoną z FAD).
Transferazy
Acylacja, deacylacja
Metylacja, demetylacja
aminacja
glikozylacja
transketolizacja, transaldolizacja
Hydrolazy
Wybierane wybiórczo dla konkretnego procesu (m.in. esterazy, proteinazy, itp.)
Liazy
EC 4.1. – rozerwanie wiązania C-C (np. dekarboksylazy)
EC 4.3. – rozerwanie wiązania C-N (np. amoniakoliaza asparaginianowa – aspartaza).
Izomerazy
Izomeryzacja (np. cis, trans)
Epimeryzacja
Racemizacja
Ligazy
Syntetazy (np. amidacja –CONH2 – syntetaza asparaginianowa)
3. Przykłady biotransformacji
Najstarszym znanym przykładem biotransformacji jest utlenienie etanolu do kwasu octowego (produkcja octu winnego). U bakterii Acetobacter występuje bardzo silnie rozwinięta zdolność do katalizowania tej reakcji (z uwagi na dehydrogenazę alkoholową). Wydajność procesu sięga 90%.
3.1. Hydroliza estrów.
Wykorzystanie biotransformacji w procesach przemysłowych wymagających stosowania wysoko selektywnych reakcji hydrolitycznych (do których należy zaliczyć znaczną część reakcji hydrolitycznego rozkładu estrów pochodzenia nie naturalnego) ograniczone jest niewielką ilością odpowiednich enzymów drobnoustrojowych. W przeciwieństwie do lipaz, esterazy właściwe- a więc o takiej specyficzności, jaką wykazują esterazy izolowane z wątroby świni (PLE) lub konia (HLE) – są słabo rozpowszechnione u drobnoustrojów. Szczęśliwie, u niektórych mikroorganizmów (m.in. u B.subtilis i B.coagulans) znaleziono nowy typ esteraz (tzw. karboksyloesterazy – NP), wykazujące wysoką specyficzność dla pewnego rodzaju substratów. Ponieważ enzymy te są częściowo lub całkowicie wewnątrzkomórkowe konieczne okazało się, używanie całych komórek bakterii (ewentualnie immobilizowanych) lub ich fragmentów w procesach biotransformacji, w których znalazły zastosowanie. Znacznie rzadziej wykorzystuje się izolowane z nich enzymy.
Wykazano, że reakcja hydrolitycznego rozkładu estrów prowadzona z udziałem bakterii z rodzaju Bacillus może być wysoce stereospecyficzna i regioselektywna, co ma niewątpliwie istotne znaczenie z praktycznego punktu widzenia, (np. przy rozdziale enancjomerów lub hydrolizie estrów związków z kilkoma chiralnymi atomami węgla). Poniżej podano kilka takich przykładów.
Przykład dotyczy hydrolizy racemicznych estrów kwasów i alkoholi z kilkoma chiralnymi atomami węgla (rys. 2). Komórki B.subtilis var. niger IFO 3108 zastosowano do hydrolizy racemicznej mieszaniny octanu trans/cis-2,trans-4-dimetylocykloheksanolu. W wyniku tej reakcji rozdzielono obydwa enancjomery, otrzymując alkohol trans-2,trans-4-dimetylocykloheksanolowy z wydajnością 94%.
Rys. 2. Hydroliza racemicznych estrów z chiralnymi atomami węgla przez B.subtilis
Przykładem może być rozdział mieszaniny podstawionych eneancjomerów a-arylo- i a-aryloksy pochodnych kwasu propionowego (rys. 1.). Pochodne te znane są dobrze jako leki przeciwzapalne (np. Naproxen) i agrochemikalia (np. Diclofop). Jednakże główną biologiczną aktywność wykazuje z reguły jedynie jeden z enancjomerów (np. S w przypadku Naproxenu). Cytowany przykład pokazuje możliwość zastąpienia konwencjonalnej metody rozdziału tych enancjomerów przez biotransformację z wykorzystaniem fragmentów komórek Bacillus sp. lub esterazy z nich izolowanej.
3.1. Produkcja aminokwasów
Naturalnie występujące w świecie ożywionym L-aminokwasy, których roczne zapotrzebowanie przekracza 1000 ton (np. kwas L-glutaminowy i L‑lizyna) produkuje się na drodze biosyntezy. Inne aminokwasy, zwłaszcza szeregu D-, które są niezwykle wartościowe dla przemysłu farmaceutycznego i agrochemicznego, otrzymuje się skojarzonymi metodami enzymatyczno-chemicznymi. Przykładem takiej metody może być produkcja D-aminokwasów poprzez stereospecyficzną (S-specyficzną) hydrolizę odpowiednich pochodnych hydantoiny. Pochodne te, stanowiące mieszaninę D- i L-enancjomerów, otrzymuje się znanymi metodami chemicznymi (np. metodą Bücherera-Berga). Z racematu tego można wydzielić D-aminokwas w procesie biotransformacji, wykorzystując komórki B.brevis lub w procesie enzymatycznej transformacji używając hydantoinazę (L-5-karboksylometylohydantoinaza – EC.3.5.2.4.) produkowaną przez te same bakterie. (rys. 6.6.).
Rys. 6.6. Rozdział pochodnych D,L-hydantoiny z wykorzystaniem enzymów bakterii Bacillus
Hydantoinaza działa stereospecyficznie, powodując rozerwanie jedynie pierścienia D-hydantoiny, w wyniku czego powstaje rozpuszczalna pochodna N‑karbamoilowa D-aminokwasu. Przy odpowiednim pH nierozpuszczalna pochodna L‑hydantoiny szybko ulega racemizacji, tak że wydajność procesu sięga 100% teoretycznej. W następnym etapie produkcyjnym powstały N‑karbamoilo D‑aminokwas poddaje się hydrolizie konwencjonalnymi metodami, otrzymując w efekcie D-aminokwas. Ostatnio podjęto próby zastosowania amidohydrolazy wytwarzanej przez B.subtilis do tego etapu produkcyjnego i wiele wskazuje na to (m.in. końcowa wydajność 92%), że próba ta ma potencjalnie dużą szansę powodzenia.
Na drodze biotransformacji hydantoiny na dużą skalę produkuje się obecnie D-(4-hydroksylofenylo)glicynę, która jest półproduktem do wytwarzania amoxiciliny, ważnego półsyntetycznego antybiotyku (o czym będzie mowa poniżej).
Jak już wspomniano do rozdziału racemicznych mieszanin niepolarnych estrów N-acetylo- DL- aminokwasów używa się subtilizyny (korzystnie, jeśli jest ona immobilizowana), wykorzystując jej zdolność do hydrolizy wyłącznie estrów L-aminokwasów (rys. 6.7.).
Rys. 6.7. Rozdział racematu estru N-acetylo- DL- aminokwasu z wykorzystaniem subtilizyny
Wypada w tym miejscu wspomnieć, że niektóre gatunki bakterii z rodzaju Bacillus zdolne są w odpowiednich warunkach do nadprodukcji aminokwasów i stąd bezpośrednio bywają używane do ich biosyntezy. I tak np. B.subtilis w podłożach hodowlanych z dodatkiem prekursora (jakim jest 2-ketomaślan) może nagromadzać L-izoleucynę, a z kolei B.flavum w podłożach z octanami nagromadza L...
Przem582