co to jest plazmid.pdf

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 231–240

M IROS£AWA W £ODARCZYK

Zak³ad Genetyki Bakterii

Instytut Mikrobiologii

Uniwersytet Warszawski

Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa

e-mail: miraw@biol.uw.edu.pl

CO TO JEST PLAZMID?

Uorganizmówprokariotycznych (bakterii i

archeonów) podstawowa informacja gene-

tyczna zawarta jest zazwyczaj w jednej, dwuni-

ciowej koliœcie zamkniêtej cz¹steczce DNA sta-

nowi¹cej tzw. chromosom. Wielkoœæ chromo-

somu prokariotycznego mierzona liczb¹ tysiê-

cy par zasad (kb) zawiera siê w przedziale od

niespe³na 600 do blisko 10000 kb. U Escheri-

chia coli , modelowego organizmu w bada-

niach genetycznych bakterii, wartoœæ ta wyno-

si 4 700 kb, co odpowiada d³ugoœci 1400 m.

W komórce chromosom jest upakowany w

zwart¹, lecz nieob³onion¹ strukturê okreœlan¹

mianem nukleoidu, funkcjonalnego odpo-

wiednika j¹dra (nukleus) eukariotycznego.

Oprócz chromosomu, w bardzo wielu komór-

kach bakteryjnych wystêpuj¹ dodatkowe ele-

menty genetyczne — plazmidy. Plazmidy nie s¹

niezbêdne do ¿ycia komórki, gdy¿ wszystkie

geny metabolizmu podstawowego (ang. house

keeping genes) zlokalizowane s¹ w chromoso-

mie, tym niemniej posiadanie plazmidów

znacznie zwiêksza zasób informacji genetycz-

nej gospodarza. Wielka ró¿norodnoœæ puli ge-

nów zlokalizowanych na plazmidach odgrywa

znacz¹c¹ rolê w zdolnoœciach adaptacyjnych

prokariotów i w ich ewolucji.

DEFINICJA

Plazmidy s¹ to autonomiczne, pozachromo-

somowe elementy genetyczne wystêpuj¹ce

(zwykle w postaci kolistych lub rzadziej linio-

wych cz¹steczek DNA) u bardzo wielu organi-

zmów prokariotycznych oraz u niektórych eu-

kariotów. Ich najbardziej charakterystyczn¹

cech¹ jest fizyczna odrêbnoœæ od chromosomu

gospodarza oraz zdolnoœæ do trwa³ego utrzy-

mywania siê (ang. maintenance) w komórce i

replikowania siê w niej w kontrolowany spo-

sób.

Czasem definicja plazmidu uzupe³niana

jest stwierdzeniem, ¿e plazmid nie koduje

funkcji, które by³yby niezbêdne do ¿ycia ko-

mórki (w „normalnych” warunkach). Konse-

kwencj¹ tego jest fakt, ¿e usuniêcie plazmidu z

komórki (tzw. wyleczenie, ang. curing) nie jest

letalne dla komórki gospodarza.

Mo¿na te¿ sformu³owaæ bardziej lakonicz-

na definicjê: „Plazmidy s¹ to samodzielne poza-

chromosomowe replikony”.

Termin „plazmid” zosta³ po raz pierwszy

oficjalnie zaproponowany przez profesora Jos-

hua Lederberga, pioniera badañ genetycznych

bakterii, w 1952 r. jako generyczna nazwa

wszystkich znanych w tym czasie „pozachro-

mosomowych cz¹stek genetycznych” (L EDER-

BERG 1952). Wbrew pozornej zgodnoœci z

podan¹ powy¿ej wspó³czesn¹ definicj¹, zna-

czenie terminu plazmid sformu³owane przez

Lederberga by³o znacznie szersze, gdy¿ obej-

mowa³o tak ró¿ne „cz¹stki genetyczne” jak pa-

232

M IROS£AWA W £ODARCZYK

so¿yty, symbionty, organelle, wirusy, episomy

itp. i mia³o na celu zasygnalizowanie, ¿e j¹dro

komórkowe nie jest wy³¹cznym „magazynem”

informacji genetycznej, mo¿e ona bowiem byæ

w ró¿nej formie zlokalizowana tak¿e w cyto-

plazmie. W obecnym znaczeniu termin pla-

zmid zacz¹³ byæ u¿ywany niemal 10 lat póŸniej.

Pewne swe przemyœlenia dotycz¹ce postêpu

badañ nad plazmidami, które ju¿ w 1978 r. za-

owocowa³y powstaniem wysoce specjalistycz-

nego czasopisma „Plasmid”, a w ostatniej deka-

dzie publikowaniem rocznie oko³o 3000 prac

dotycz¹cych problematyki plazmidowej,

przedstawi³ Lederberg w rocznicowym (45 lat

od u¿ycia terminu „plasmid”) artykule

(L EDERBERG 1997).

ODKRYCIE I POCZ¥TEK BIOLOGII PLAZMIDÓW

Pierwszym czynnikiem genetycznym spe³-

niaj¹cym kryteria wspó³czesnej definicji pla-

zmidów by³ tzw. faktor F. Odkryty zosta³ on na

prze³omie lat 40. i 50. ubieg³ego wieku. pod-

czas badañ nad rekombinacj¹ u Escherichia

coli K12. Nazwa faktor F pochodzi od angiel-

skiego terminu Fertility — p³odnoœæ, gdy¿ po-

siadanie przez komórkê takiego faktora warun-

kowa³o jej p³odnoœæ, rozumian¹ jako zdolnoœæ

do jednokierunkowego przekazywania mate-

ria³u genetycznego podczas bezpoœredniego

kontaktu z inn¹ komórk¹. O istnieniu czynnika

p³odnoœci wnioskowano wtedy wy³¹cznie na

podstawie eksperymentów z zakresu klasycz-

nej analizy genetycznej. To, ¿e czynnik F zbu-

dowany jest z DNA i wystêpuje w formie wol-

nej w cytoplazmie komórki wykazano 10 lat

póŸniej. Wykorzystano tumetodê ultrawirowa-

nia w gradiencie gêstoœci chlorku cezu

(M ARMUR i wspó³aut. 1961), która ujawni³a po-

jawianie siê w Serratia marcescens (której

chromosom zawiera 58% par GC), po koniuga-

cji z E. coli (F + ), dodatkowej frakcji DNA o za-

wartoœci par GC = 50%, czyli charakterystycz-

nej dla DNA E. coli. Faktem, który zainicjowa³

postêp badañ nad plazmidami i przeniós³ je z

poziomu analizy pewnego rodzaju ciekawostki

naukowej do sfery badañ maj¹cych bezpoœred-

nie znaczenie dla zdrowia cz³owieka, by³o od-

krycie, ¿e czynniki genetyczne odpowiedzial-

ne za gwa³towne rozprzestrzenianie siê tzw.

wielorakiej opornoœci na antybiotyki w czasie

epidemii czerwonki w Japonii w koñcu lat 50.

ubieg³ego wieku wykazuj¹, istotne podobie-

ñstwa do czynnika F. Pierwszym opisanym pla-

zmidem z grupy plazmidów opornoœciowych

„R” (ang. Resistance), by³ plazmid NR1 (znany

tak¿e jako R100 i R222) izolowany z Shigella

flexneri strain 222/CTS, warunkuj¹cy opor-

noœæ na chloramfenikol, tetracyklinê i strepto-

mycynê (M ITSUHASHI i wspó³aut. 1960). Obec-

nie, plazmidy typu R s¹ najliczniejsz¹ grup¹

spoœród wszystkich opisanych. Na pocz¹tku lat

70. zidentyfikowano pierwsze plazmidy kata-

boliczne (TOL, CAM, OCT itp.). Wczesne lata

70. to tak¿e okres, w którym z wykorzystaniem

naturalnych plazmidów, wykonano pionier-

skie eksperymenty bêd¹ce podstaw¹ rozwoju

techniki zwanej in¿ynieri¹ genetyczn¹. Pierw-

szym takim eksperymentem, przeprowadzo-

nym w Stanford University przez grupê ba-

dawcz¹ Stanleya Cohena, by³o wstawienie frag-

mentu genu koduj¹cego opornoœæ na kanamy-

cynê do ma³ego plazmidu pSC101 nios¹cego

cechê opornoœci na tetracyklinê (C OHEN i

wspó³aut. 1973).

Od tego czasu badania nad plazmidami po-

toczy³y siê dwiema drogami. Pierwsza to tzw.

biologia plazmidów, a wiêc obszar badañ, w

którym plazmid jako taki stanowi przedmiot

badañ; analizowana jest struktura cz¹steczki,

wszelkie mechanizmy stanowi¹ce o jego stabil-

nym utrzymywaniu siê w populacji bakterii

(ang. maintenance functions), analiza funkcji

fenotypowych kodowanych przez geny obec-

ne w naturalnych plazmidach, mechanizmy

przekazywania plazmidów w obrêbie gatunku

oraz miêdzy gatunkami bakterii, znaczenie

tego procesu w ogólnie ujmowanym procesie

horyzontalnego transferu genów, ewolucja

plazmidów itp. Typowym przyk³adem potrak-

towania plazmidu jako fascynuj¹cego obiektu

biologicznego mo¿e byæ ksi¹¿ka Davida

Summersa, w której nie pada ani razu termin

„wektor” (S UMMERS 1996). Drugi sposób spoj-

rzenia na plazmidy to spojrzenie czysto instru-

mentalne — plazmid jako doskona³e narzêdzie

in¿ynierii genetycznej, czyli zespo³u nowocze-

snych technik biologii molekularnej umo¿li-

wiaj¹cych przeprowadzanie rekombinacji ge-

netycznej genami in vitro (lub jak okreœlaj¹ to

niektórzy: celowe manipulowanie genami in

vitro ). Cz¹steczki plazmidów sta³y siê istotnie

podstaw¹ konstrukcji doskona³ych i ró¿norod-

nych wektorów do klonowania genów, jest to

prawda niepodwa¿alna, lecz niew¹tpliwie na-

Co to jest plazmid?

233

tura nie „stworzy³a” plazmidów z takim za-

mys³em. W przedstawianym czytelnikom opra-

cowaniu podejmujemy próbê zaprezentowa-

nia obu zasygnalizowanych aspektów badañ

nad plazmidami.

STRUKTURA CZ¥STECZKI PLAZMIDOWEJ

Wiêkszoœæ plazmidów to koliste cz¹steczki

dwuniciowego DNA tworz¹ce strukturê tzw.

CCC-DNA (ang. covalently closed circle), która

wykazuje negatywne superskrêcenie (wyj¹t-

kiem s¹ plazmidy izolowane z hypertermofil-

nych Archaea, u których udokumentowano po-

zytywne superskrêcenie cz¹steczek DNA pla-

zmidowego, co jak siê wydaje jest jednym z ele-

mentów ich przystosowania do funkcjonowa-

nia w temperaturach powy¿ej 100 C). Przez

wiele lat s¹dzono, ¿e wszystkie plazmidy bakte-

ryjne wystêpuj¹ w formie CCC-DNA (Ryc. 1A),

co powodowa³o, ¿e ta cecha struktury cz¹stecz-

stêpuj¹cy na przyk³ad u Streptomyces , jest to

„prawdziwa” liniowa cz¹steczka dwuniciowe-

go DNA (posiadaj¹ca wolne koñce), której

cech¹ charakterystyczna jest obecnoœæ bia³ek

terminalych (TP) po³¹czonych z koñcem 5’-

³añcucha DNA (Ryc. 1B). Bia³ka te chroni¹ DNA

przed atakiem komórkowych 5’-egzonukleaz, a

czasem, podobnie jak u adenowirusów, mog¹

pe³niæ rolê startera w replikacji cz¹steczki

DNA. Wszystkie plazmidy tej grupy posiadaj¹

tak¿e d³ugie terminalne powtórzenia. Drugi

typ, zwany typem „szpilki do w³osów” (ang. ha-

irpin loop) to cz¹steczki widoczne w mikro-

skopie elektronowym jako struktury liniowe,

lecz których koñce s¹ kowalencyjnie po³¹czo-

ne. Przyk³adem mo¿e byæ 16 kb liniowy pla-

zmid z Borrelia burgdorferi (H INNEBUSCH i

B ARBOUR 1991). Plazmid ten to jeden polinu-

kleotydowy ³añcuch, który jest komplementar-

ny na ca³ej swej d³ugoœci, z wyj¹tkiem krótkich

naprzeciwleg³ych odcinków, w wyniku czego

powstaj¹ jednoniciowe pêtle (Ryc. 1C)) na ko-

ñcach p³askiej liniowej dwuniciowej struktury

(st¹d nazwa „hairpin loop’). Taki plazmid po

denaturacji tworzy jedn¹ jednoniciow¹ kolist¹

cz¹steczkê.

W literaturze spotykany jest czasem termin

„plazmidy jednoniciowe”. Nale¿y wyjaœniæ, ¿e

plazmidy jednoniciowe, to nie jest kolejna na-

turalna forma strukturalna plazmidów. Termin

ten odnosi siê do poœredniej formy replikacyj-

nej wystêpuj¹cej w szlaku replikacyjnym pla-

zmidów bakterii Gram-dodatnich repli-

kuj¹cych siê wed³ug mechanizmu „tocz¹cego

siê ko³a” (ang. roling circle replication, RCR).

Przy pewnych zaburzeniach procesu replikacji

mo¿e nastêpowaæ nagromadzanie siê tych jed-

noniciowych kolistych formw komórce do ilo-

œci wykrywalnej metodami fizykochemiczny-

mi. Z kolei, widoczne czasem w preparatach

mikroskopii elektronowej lub w obrazach

elektroforetycznych, formy OC i liniowe towa-

rzysz¹ce klasycznej postaci CCC-DNA, s¹ naj-

czêœciej wynikiem przekszta³ceñ formy CCC w

wyniku zerwania (pêkniêcia) jednego lub

dwóch naprzeciwleg³ych wi¹zañ fosfodwu-

estrowych w cz¹steczce kolistej.

ori

3’

Ryc. 1. Formy strukturalne naturalnych plazmi-

dów bakteryjnych.

A — Plazmid kolisty w formie CCC-DNA (kowalentnie

zamkniêtego ko³a). B — Plazmid liniowy; TP — bia³ka

terminalne, ori — punkt startu replikacji.C—Plazmid

liniowy typu “hairpin loop”

ki plazmidu by³a (i czasem wci¹¿ jest) umiesz-

czana w jego definicji. Takiemu pogl¹dowi

sprzyja³o powszechne stosowanie do izolacji i

oczyszczania plazmidów metod preferuj¹cych

tê formê strukturaln¹ DNA (patrz nastêpny roz-

dzia³). Nie wszystkie jednak plazmidy s¹ koli-

ste, pierwsze liniowe plazmidy wykryto na

pocz¹tku lat 80. u dro¿d¿y Kluyveromyces lac-

tis , a wkrótce tak¿e u bakterii, np. u przedstawi-

cieli rodzajów Streptomyces, Borrelia, Nocar-

dia, Rhodococcus (M EINHARDT i wspó³aut.

1997). Wœród plazmidów liniowych wyró¿nia-

my dwa typy strukturalne. Pierwszy z nich, wy-

234

M IROS£AWA W £ODARCZYK

WIELKOŒÆ

Wielkoœæ plazmidów jest bardzo zró¿nico-

wana i zawiera siê w granicach od oko³o 1000

par zasad (1 kb) do nawet oko³o 1700 kb. Naj-

mniejsze plazmidy, o wielkoœci nieznacznie

przekraczaj¹cej 1 kb, zidentyfikowano w He-

amophilus somnus, Mycoplasma sp. i Helico-

bacter pylori (kompletne sekwencje tych pla-

zmidów znajduj¹ siê w bazie danych NCBI). Z

kolei plazmidy o górnej granicy podanej wiel-

koœci, zwane megaplazmidami, zosta³y zidenty-

fikowane wœród przedstawicieli Rhizobium i

s¹ to czêsto plazmidy odpowiedzialne za pro-

ces symbiotycznego wi¹zania azotu (pSym)

przez gospodarza (B ANFALVI i wspó³aut. 1981).

Wielu badaczy mianem megaplazmidów okre-

œla tak¿e plazmidy o wielkoœci poni¿ej 1 Mb

(1000 kb), nawet ju¿ plazmidy o wielkoœci 150

–200 kb (0,15–0,2 Mb), czyli po prostu bardzo

du¿e.

Dolna wartoœæ wielkoœci plazmidu wyzna-

czana jest minimaln¹ iloœci¹ informacji gene-

tycznej potrzebnej do kodowania funkcji abso-

lutnie niezbêdnych do jego powielenia (repli-

kacji), nie pozostawiaj¹c praktycznie miejsca

na kodowanie ¿adnych dodatkowych cech fe-

notypowych. W takiej sytuacji mielibyœmy do

czynienia z tzw. „prawdziwym” plazmidem

kryptycznym. Z kolei górna granica wielkoœci

plazmidu mo¿e przekraczaæ nawet wielkoœæ

chromosomów niektórych bakterii (np. chro-

mosom Mycoplasma genitalium ma 580 kb,

Helicobacter pylori 1600 kb). Sama tylko wiel-

koœæ cz¹steczki DNA nie mo¿e wiêc byæ para-

metrem rozró¿niaj¹cym pomiêdzy plazmidem

a chromosomem. Z regu³y du¿e plazmidy to te,

które nios¹ geny warunkuj¹ce z³o¿one procesy

fizjologiczne (np. zdolnoœæ do koniugacji),

skomplikowane szlaki metaboliczne (plazmidy

kataboliczne, np. pWW0) lub opornoœæ na kil-

ka antybiotyków i innych substancji antybakte-

ryjnych (np. plazmid NR1, RK2). Znaj¹c wiel-

koœæ plazmidu ³atwo jest w przybli¿eniu osza-

cowaæ ile œredniej wielkoœci bia³ek mo¿e byæ

kodowanych przez jego genom, czyli okreœliæ

tzw. teoretyczn¹ pojemnoœæ koduj¹c¹ plazmi-

du (przyjmujemy, ¿e gen koduj¹cy œredniej

wielkoœci bia³ko, 30 kDa, zajmuje 1 kb). Takie

szacunki daj¹ nam wyobra¿enie jaki procent

ca³kowitej, niesionej przez komórkê informa-

cji genetycznej, „przypada” na informacjê nie-

sion¹ przez plazmid. Wartoœæ ta dla modelowe-

go uk³adu: komórka E. coli nios¹ca plazmid F

(czyli szczep F + ) wynosi 2%, ale mo¿e osi¹gaæ

wartoœci nawet do kilkudziesiêciu procent w

przypadku bardzo du¿ych lub wielokopio-

wych plazmidów.

NAZEWNICTWO

Zanim opracowano metody wykazywania

fizycznej obecnoœci DNA plazmidowegowko-

mórkach (patrz nastêpny rozdzia³), o obecno-

œci plazmidów wnioskowano na podstawie

cech fenotypowych, jakie ich obecnoœæ nada-

wa³a komórkom gospodarza. Konsekwencj¹

tego by³o nazywanie plazmidów w oparciu o

te w³aœnie cechy. I tak, jak ju¿ wspomnia³am,

nazwa plazmidu F pochodzi od cechy p³odno-

œci (ang. fertility), która zale¿y od jego obec-

noœci w komórce E. coli . Plazmidy nios¹ce

geny opornoœci na antybiotyki, to plazmidy R.

Dla pierwszego z nich przyjêto nazwê NR1

(pierwszy plazmid R opisano wNational Insti-

tute of Health w Japonii), kolejne obok ozna-

czenia R zyskiwa³y dodatkowo numery lub

symbole literowe. Plazmidy degradacyjne (ka-

taboliczne) TOL, CAM, OCT itp. oznaczono

symbolami informuj¹cymi jakie substancje s¹

degradowane pod kontrol¹ tych¿e plazmidów

(odpowiednio: TOLuen, CAMphor, OCTane).

Plazmidy odpowiedzialne za produkcjê koli-

cyn przez Escherichia coli to grupa plazmidów

Col (ColE1, ColIb, ColV itd.). W miarê lawino-

wego zwiêkszania siê liczby nowoodkrywa-

nych (a potem tak¿e konstruowanych in vi-

tro ) plazmidów, tego typu nazewnictwo sta³o

siê ma³o przejrzyste i wprowadzaj¹ce szereg

nieporozumieñ. W zwi¹zku z tym zapropono-

wano standaryzacjê nazewnictwa plazmidów,

której zasady opublikowano w 1976 r.

(N OVICK i wspó³aut. 1976). Od tego czasu pla-

zmidy winny byæ oznaczane symbolami i nu-

merami, podobnie jak szczepy bakteryjne, a

wybrany symbol winien byæ poprzedzony

prefiksem „p” — od plazmid. Zwykle symbole

literowe pochodzi³y od nazwisk odkrywców. I

tak np. pBR322 — plazmid skonstruowany

przez Bolivara i Rodrigueza jako 322 plazmid

w ich kolekcji, po wprowadzeniu do niego

genu opornoœci na chloramfenikol zyska³

oznaczenie pBR325. Znany powszechniema³y

plazmid opornoœciowy z kolekcji Stanleya Co-

hena nosi nazwê pSC101, z kolei seria plazmi-

Co to jest plazmid?

235

dów pUB pochodzi z laboratorium University

of Bristol. Te zasady nazewnictwa plazmidów

zosta³y zaakceptowane i wesz³y do powszech-

nego u¿ycia, jednak wiele utrwalonych trady-

cj¹ nazw pozosta³o niezmienionych (F, ColE1,

RK2 itp.). Prawdopodobnie niewielu badaczy

(zw³aszcza m³odych) zajmuj¹cych siê plazmi-

dami pamiêta, ¿e w 1977 r. za³o¿ony zosta³

centralny oœrodek rejestruj¹cy i wydaj¹cy cer-

tyfikaty legalnoœci u¿ywania wybranych sym-

boli plazmidów, po ustaleniu, ¿e nie zosta³y

one dotychczas wykorzystane przez inn¹ oso-

bê. Oœrodek „The Plasmid Reference Center

(PRC)” funkcjonowa³ przy Stanford Universi-

ty, a by³ prowadzony przez ¿onê profesora Le-

derberga — Esther Lederberg. Okresowo pu-

blikowane by³y bie¿¹ce listy „Plasmid Prefix

Designations Registered by PRC” (L EDERBERG

1986). O ile wiem, zwyczaj rejestracji ozna-

czeñ plazmidów zosta³ jakiœ czas temu zarzu-

cony, dlatego przed u¿yciem wybranego

przez siebie oznaczenia plazmidu w oficjalnej

publikacji warto sprawdziæ w odpowiednich

bazach danych, czy nie powielamy u¿ytego

wczeœniej symbolu, aby unikn¹æ mog¹cych

wynikn¹æ z tego nieporozumieñ.

KLASYFIKACJA

Wmiarê odkrywania coraz to wiêkszej licz-

by plazmidów i opisywania niezwyk³ej ró¿no-

rodnoœci funkcji przez nie kodowanych poja-

wi³a siê naturalna w biologii potrzeba opraco-

wania systemu ich klasyfikacji. Pierwsze syste -

my klasyfikacji plazmidów oparte by³y o feno-

typy komórek gospodarza, które zale¿a³y od

obecnoœci okreœlonego plazmidu (lub grupy

plazmidów). Wyró¿niono wiêc np. plazmidy

„koniugacyjne” (plazmid F), warunkuj¹ce

opornoœæ na antybiotyki (NR1, RK2), bakterio-

cynogenne (ColE1), degradacyjne (TOL), sym-

biotyczne (pSYM) itd. Klasyfikacja taka, aczkol-

wiek dla pewnych celów u¿yteczna, ma szereg

niedogodnoœci, z których na pierwszym miej-

scu nale¿y podkreœliæ, ¿e jest to klasyfikacja nie-

wyklucz¹j¹ca (lub zachodz¹ca), gdy¿ wed³ug

niej wiele plazmidów nale¿a³oby w³¹czyæ do

dwóch lub nawet trzech grup (np. plazmidy R1

czy RK2 to plazmidy opornoœciowe, ale tak¿e

koniugacyjne). Powsta³a próba opracowania

schematu klasyfikacji opartego o cechê, która

by³aby unikatowa dla ka¿dej wyró¿nionej gru-

py. Po poznaniu zjawiska niezgodnoœci plazmi-

dów, które definiujemy jako niemo¿noœæ

wspó³istnienia dwóch plazmidów w jednej li-

nii komórkowej, tê w³aœnie cechê odzwiercie-

dlaj¹c¹ stopieñ pokrewieñstwa systemów re-

plikacyjnych plazmidów, przyjêto za podstawê

klasyfikacji. Pionierskie próby takiej klasyfika-

cji podjê³a Naomi Datta ju¿ we wczesnych la-

tach 70., a podsumowuje je praca z 1979 r.

(D ATTA 1979). Wtedy system kwalifikowania

plazmidu do odpowiedniej grupy niezgodno-

œci (Inc) prowadzono metodami genetyki kla-

sycznej, co by³o procedur¹ doœæ ¿mudn¹. No-

woczesny, wprowadzony przed kilkunastu laty

system tzw. typowania replikowanego, oparty

na stwierdzaniu homologii (lub jej braku) miê-

dzy replikonami przy u¿yciu technik hybrydy-

zacji DNA, z wykorzystaniem odpowiednich

specyficznych sond molekularnych reprezen-

tuj¹cych ró¿ne grupy niezgodnoœci, pozwoli³

na znaczny postêp w klasyfikacji plazmidów.

Najpe³niejszy system tego typu klasyfikacji, wy-

ró¿niaj¹cy oko³o 30 grup niezgodnoœci, stwo-

rzono dla plazmidów z Enterobacteriaceae

(C OUTURIER i wspó³aut. 1988).

METODY IDENTYFIKACJI PLAZMIDÓW

Zwiêz³e omówienie tego zagadnienia nie

jest proste, a nie jest moj¹ intencj¹ przedsta-

wianie przegl¹du technik eksperymentalnych

do tego celu wykorzystywanych. Najogólniej

mówi¹c, o obecnoœci plazmidu(ów) w komór-

ce bakteryjnej mo¿emy wnioskowaæ poœred-

nio, na podstawie cechy fenotypowej gospoda-

rza zale¿nej od potencjalnej obecnoœci plazmi-

du lub na podstawie bezpoœredniego wykaza-

nia (metodami fizykochemicznymi) obecnoœci

DNA plazmidowego w komórce. Wpierwszym

przypadku d¹¿ymy do udowodnienia korelacji

pomiêdzy jak¹œ konkretn¹ w³aœciwoœci¹ fizjo-

logiczn¹ badanych bakterii a potencjaln¹ obec-

noœci¹ pozachromosomowego czynnika tê ce-

chê warunkuj¹c¹. Klasyczny przyk³ad (dziêki

któremu odkryto plazmid F, a tak¿e pierwsze

plazmidy opornoœciowe, R) to analiza kinetyki

rozprzestrzeniania siê analizowanej cechy w

populacji komórek. Cechy o plazmidowej loka-

lizacji (przy za³o¿eniu, ¿e mamy doczynienia z

plazmidem koniugacyjnym) bêd¹ rozprze-

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: