1. Wstęp teoretyczny
Białka to związki wielkocząsteczkowe zbudowane z ponad 100 reszt L-α-aminokwasów połączonych kowalencyjnym wiązaniem peptydowym powstałym z połączenia grupy α-karboksylowej jednego aminokwasu z grupą α-aminową kolejnego aminokwasu.
W organizmie białka pełnią różnorodne funkcje:
o Strukturalne – obok wody białko to podstawowy budulec komórek i substancji międzykomórkowej
o Regulacyjne – enzymy, niektóre hormony
o Receptorowe – receptory błonowe i wewnątrzplazmatyczne odbierające i przekazujące sygnały
o Transportujące – np. białka kanałów jonowych w błonie komórkowej czy też białka osocza krwi lub hemoglobina erytrocytów
o Obronne – przeciwciała zaangażowane w reakcje immunologiczne
o Zapasowe – u roślin w nasionach i organach wegetatywnych
Kolejność poszczególnych aminokwasów w łańcuchu białka czyli tzw. sekwencja aminokwasów określana jest mianem struktury pierwszorzędowej białka. Determinowana jest ona wiązaniami peptydowymi. Struktura pierwszorzędowa jest determinowana genetycznie. Struktura drugorzędowa to pierwotne zwinięcie łańcucha polipeptydowego w przestrzeni. Gdy sposób wzajemnego ułożenia reszt aminokwasów powtarza się regularnie, mamy do czynienia ze strukturami periodycznymi takimi jak α-helisa i β-harmonijka. Strukturę drugorzędową determinują wiązania wodorowe między atomami tworzącymi jednostki peptydowe (pomiędzy grupami i ). Struktura trzeciorzędowa to wtórne zwinięcie łańcucha polipeptydowego. Determinują ją oddziaływania hydrofobowe, siły van der Waalsa, mostki solne (wiązania jonowe) i mostki disiarczkowe oraz wiązania wodorowe. Struktura czwartorzędowa jest to wzajemne ułożenie łańcuchów polipeptydowych w białku oligomerycznym (zbudowanym z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego). Strukturę czwartorzędową stabilizują oddziaływania hydrofobowe i siły van der Waalsa.
Każdy organizm cudzożywny (heterotroficzny) posiada w swoim organizmie enzymy, które rozkładają białka na pojedyncze aminokwasy. Są to enzymy proteolityczne.
2. Część doświadczalna
2.1. Rozpuszczalność i wysalanie
2.1.1. Izolowanie białek roślinnych
2.1.1.1. Ekstrahowanie albumin i globulin
Wykonanie:
1 g mączki grochowej ekstrahować 25 ml 0,5 M roztworu KCl, w kolbie erlenmeyrce ok. 15 minut, po czym całość odwirować i uzyskaną ciecz nadosadową (supernatant) analizować w następujący sposób:
a) Wykazać zawartość białka za pomocą reakcji biuretowej: do 2 ml supernantantu dodać 2 ml 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 1% roztworu CuSO4. Próbę wykonać również dla wody i białka jaja kurzego.
b) Stwierdzić obecność albumin i globulin: do dwu probówek odmierzyć po 1 ml ekstraktu mączki, następnie do jednej dodać 8 ml wody, a do drugiej 8 ml 0,5 M roztworu KCl. Do próby, w której nastąpi zmętnienie dodać parę kropli roztworu KCl.
Obserwacje:
a) W wyniku reakcji biuretowej próba kontrolna dodatnia przeprowadzona na roztworze białka jaja kurzego zabarwiła się na fioletowo. Próba kontrolna ujemna z wodą zabarwiła się na kolor lekko błękitny. Próba badana (suprenatant) w wyniku reakcji biuretowej uzyskała kolor zbliżony do koloru próby kontrolnej dodatniej (fioletowy).
b) W probówce z ekstraktem z mączki grochowej i wodą nastąpiło zmętnienie roztworu, które zanikło po dodaniu kilku kropel chlorku potasu. W probówce, w której do ekstraktu z mączki grochowej dodano chlorek potasu roztwór pozostał klarowny.
Wnioski:
a) Odczyn dodatni reakcji biuretowej dają związki mające co najmniej dwa przylegające do siebie wiązania peptydowe. Dwie przyległe grupy –CO-NH- tworzą wiązanie koordynacyjne z atomem miedzi i wytwarza się kompleks o fioletowej barwie. Reakcja służy do wykrywania białek w roztworze.
Zmiana barwy ekstraktu z mączki oraz białka jaja kurzego w wyniku reakcji biuretowej na kolor fioletowy potwierdza zawartość białka w badanym roztworze.
Wyekstrahowane białko to albuminy i globuliny.
b) Zmętnienie zaobserwować można było w próbówce z ekstraktem z mączki grochowej i wodą. Świadczy to o tym, że w roztworze obecne były nierozpuszczalne w wodzie białka - globuliny. Białka te do rozpuszczenia wymagają obecności dobrze dysocjującej na jony soli, dlatego po dodaniu do próby roztworu chlorku potasu rozpuściły się, a roztwór stał się klarowny. Globuliny uległy więc procesowi wsalania, czyli zwiększenia rozpuszczalności w wodzie po dodaniu do roztworu soli.
Oczywiście w próbie, w której znajdował się ekstrakt z mączki grochowej i woda obecne były również albuminy, ale iż są to białka rozpuszczalne w wodzie to już na samym początku uległy rozpuszczeniu.
W probówce z ekstraktem z mączki grochowej i chlorkiem potasu nie wystąpiło zmętnienie, gdyż zarówno globuliny, jak albuminy są rozpuszczalne w obecności jonów soli.
2.1.1.2. Wydzielanie glutenu
Z 30 g mąki pszennej i wody przygotować twarde ciasto, odstawić na 15 minut, w celu uwodnienia i spęcznienia białka. Następnie wypłukiwać z ciasta skrobię wygniatając je w strumieniu zimnej, bieżącej wody. Otrzymaną pozostałość o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuścić w 30 ml 0,2M roztworu NaOH i na tak przygotowanym roztworze wykonać reakcję biuretową. Próba kontrola reakcji biuretowej dla wody i dla białka jaja kurzego została wykonana w pierwszym ćwiczeniu.
W wyniku reakcji biuretowej badany roztwór zabarwił się na kolor fioletowy.
W wyniku reakcji biuretowej próba kontrolna dodatnia przeprowadzona na roztworze białka jaja kurzego zabarwiła się na fioletowo. Próba kontrolna ujemna z wodą zabarwiła się na kolor lekko błękitny.
Wykonanie reakcji biuretowej dla badanego roztworu potwierdziło obecność w nim białka, gdyż nastąpiła zmiana barwy roztworu na fioletowy, co świadczy o dodatnim odczynie reakcji. W badanym roztworze znajdowało się wyekstrahowane z ciasta białko - gluten, które ma zdolność rozpuszczania się w rozcieńczonych roztworach zasad.
2.1.2. Wysalanie białek
Do 10 ml roztworu białka jaja kurzego dodawać porcjami stały preparat siarczanu amonowego aż do nasycenia roztworu solą. Osad wysolonego białka oddzielić na sączku i rozpuścić bezpośrednio na sączku roztworem 0,5 M KCl. W uzyskanym roztworze sprawdzić obecność białka reakcją biuretową. Do przesączu, otrzymanego po oddzieleniu osadu białka dodać kilka kropli kwasu trójchlorooctowego.
Próba kontrola reakcji biuretowej dla wody i dla białka jaja kurzego została wykonana w pierwszym ćwiczeniu.
W wyniku zastosowania metody biuretowej roztwór z rozpuszczonym w chlorku potasu osadem wysolonego białka zmienił kolor na fioletowy. Po dodaniu niewielkiej ilości kwasu trójchlorooctowego do przesączu nie wytrącił się osad.
Zmiana barwy roztworu rozpuszczonego osadu na fioletowo - niebieską, po przeprowadzeniu reakcji biuretowej, świadczy o obecności białka w roztworze.
Kwas trójchlorooctowy jest kwasem organicznym, który ma właściwości denaturacji i wytrącania białek z roztworu. Brak osadu w przesączu po dodaniu kwasu trójchlorooctowego świadczy więc o całkowitym wysoleniu białka z roztworu. Gdyby białko było źle wysolone w reakcji z kwasem trójchlorooctowym wydzieliłby się osad.
Białko jaja kurzego to owoalbumina, a więc jest rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli, dlatego osad białka na sączku został rozpuszczony w chlorku potasu.
Wysalanie polega na dehydratacji (likwidacji wodnej otoczki) cząsteczek białka. Wyższe stężenia soli (zależnie od natury samego białka i pH środowiska) powodują wypadanie białek z roztworu. w celu wysalania białek stosuje się sole o dobrym powinowactwie do wody, których jony łatwo tworzą wodziany. Wysalanie jest procesem odwracalnym i nie powoduje zmian rodzimych właściwości białek.
2.2. Białka jako koloidy
Do dwóch probówek odmierzyć po 1 ml 0,01 M roztworu azotanu srebra, do jednej próby dodać 1 ml roztworu białka jaja kurzego, do drugiej tę samą ilość wody. Po wymieszaniu wprowadzić do każdej probówki 0,01 M roztwór chlorku sodu.
Po dodaniu chlorku sodu do obu probówek w próbce z wodą wydzielił się biały osad, natomiast w próbie z białkiem jaja kurzego roztwór pozostał klarowny.
W probówce zawierającej białko można było zaobserwować działanie ochronne koloidów białkowych. Chlorek srebra to związek hydrofobowy. Białko pełni funkcję stabilizatora i otacza hydrofobowe cząsteczki AgCl narzucając im hydrofilowy charakter.
W probówce z wodą wytrącił się hydrofobowy osad AgCl, co świadczy o braku obecności koloidu hydrofilowego.
2.3. Amfoteryczność białek
2.3.1. Strącanie białek za pomocą kationów i anionów
Do dziewięciu probówek odmierzyć po 2 ml roztworu białka jaja kurzego odpowiednio o pH równym 8,0; 4,7 i 3,0. Do poszczególnych probówek dodawać kroplami 10% siarczan miedzi, 10% octan ołowiu, 10% wolframian sodu.
Po dodaniu siarczanu miedzi osad soli wytrącił się jedynie przy pH= 8,0; po dodaniu octanu ołowiu (II) osad wytrącił się tylko przy pH=8,0 a po dodaniu wolframianu sodowego osad wytrącił się przy pH=3,0. Próby o pH=4,7 pozostały klarowne.
Tabela 1. Zmiany zachodzące w roztworach białka jaja kurzego o danym pH po dodaniu wymienionych roztworów soli.
Odczynnik
1% roztwór białka jaja kurzego
pH=8,0
pH=4,7
pH=3,0
10% siarczan miedziowy
+
-
10% octan ołowiu (II)
10% wolframian sodowy
Oznaczenia użyte w tabeli:
+ wydzielenie osadu
- brak osadu
...
jula175764