Antybiotyki

Antybiotyki są to substancje działające hamująco na procesy ważne dla życia drobnoustrojów. Poznano już około dwóch tysięcy substancji antybiotycznych wytwarzanych przez bakterie, pleśnie, grzyby, poro­sty, glony, rośliny wyższe i zwierzęta. Większość antybiotyków jest wytwarzana przez drobnoustroje zaliczane do promieniowców, pleśni i laseczek. Niektóre antybiotyki udało się otrzymać całkowicie synte­tycznie (chloramfenikol), inne zaś półsyntetycznie (ampicylina, kloksacylina, dikloksacylina).

Antybiotyki obejmują niemal wszystkie struktury chemiczne. Zasto­sowanie kliniczne znalazło dotychczas około 150 antybiotyków o róż­nym zakresie działania. Podział produkowanych antybiotyków według ich praktycznego działania przedstawiono w tabeli 2.

Spośród antybiotyków wyróżniamy takie, których zakres działania jest duży, to znaczy działają na drobnoustroje należące do różnych ro­dzajów i rodzin, lub też antybiotyki działające tylko na nieliczne ga­tunki lub grupy drobnoustrojów. Szczepy należące do tego samego ga­tunku mogą być w różnym stopniu podatne na działanie antybiotyku.

Szczepy, na które antybiotyk działa, w stężeniach łatwo osiągalnych w surowicy krwi i w tkankach, nazywamy wrażliwymi, w przeci­wieństwie do szczepów opornych, niewrażliwych na działanie anty­biotyku. Szczepy wrażliwe mogą w pewnych warunkach nabywać opor­ność. Zdolność do nabywania oporności należy do zjawisk niepożąda­nych i stanowi jeden z najpoważniejszych problemów leczenia anty­biotykami. Rozwój oporności zachodzi z różną łatwością u rozmaitych drobnoustrojów, np. bardzo łatwo u gronkowców i pałeczek ropy błę­kitnej, trudno u dwoinek rzeżączki i niektórych paciorkowców. Szyb­kość powstawania oporności na różne antybiotyki nie jest jednakowa.

Tabela 2

Podział produkowanych antybiotyków według praktycznego zakresu ich działania (wg Kuryłowicza i Kowszyk-Gindifer)

Mechanizm działania antybiotyków

Silne działanie przeciwdrobnoustrojowe antybiotyków stało się przy­czyną badania mechanizmów tego zjawiska. Poznane mechanizmy dzia­łania okazały się zróżnicowane. Procesy fizykochemiczne mogą być ha­mowane lub zaburzane aż do zakłócania ciągów metabolicznych. Uszka­dzane mogą być procesy swoiste dla drobnoustrojów lub" wspólne dla bakterii i makroustrojów. W pierwszym przypadku antybiotyk jest nie­toksyczny, w drugim mniej lub bardziej toksyczny. Są antybiotyki inter-ferujące z syntezą białek, puryn, kwasów nukleinowych, przemianami aminokwasów lub peptydów. Miejscem działania może być ściana ko­mórkowa, na którą działają penicyliny, cefalosporyny, cykloseryna,

Ryć. 8. Podział antybiotyków według ich mechanizmu działania:

1 — antybiotyki wpływające na replikacje informacji genetycznych: kwas nalidy-ksowy, gry zeof lawina;

2 — antybiotyki zaburzające przekazywanie informacji genetycznych w biosyntezie: chloramfenikol, erytromycyna, kanamycyna, streptomycyna, tetracykliny, linnomycy-na, neomycyna-,

3 — antybiotyki uszkadzające strukturą i czynność bakteryjnej ściany komórkowej: penicyliny, cykloseryna, rystocetyna, cefalosporyny, wankomycyna, bacytracyna-,

4 — antybiotyki powodujące zaburzenia czynności błony komórkowej: gramicydyna, polimiksyna B, amfoterycyna B, tyrotrycyna, kolistyna, nystatyna.

bacytra cyna i wankomycyna (ryć. 8). Strukturę błony cytoplazmatycznej zaburzają: polimiksyna B, kolistyna i gramicydyna. Na syntezę białka zachodzącą w strukturach plazmatycznych wpływają tetracykliny, chlo-ramfenikol, streptomycyna, gentamycyna, neomycyna i erytromycyna. Na syntezę DNA i RNA działają: kwas nalidyksowy i aktynomycyna.

Oporność drobnoustrojów na antybiotyki

W roku 1939 MacLean, Rogers i Fleming zaobserwowali rozwój szczepu gronkowca opornego na sulfonamidy u pacjenta leczonego sulfapirydy-ną. W roku 1941 Abraham i wsp. otrzymali szczepy gronkowców opor­ne na penicylinę in vitro. W ciągu następnych kilku lat opisano powsta­wanie szczepów opornych na streptomycynę, chloramfenikol i antybio­tyki tetracyklinowe. Obecnie znaczny procent szczepów jest oporny na sulfonamidy i antybiotyki stosowane w lecznictwie.

Stwierdzono również, że prawie wszystkie gatunki drobnoustrojów mogą dawać szczepy oporne na antybiotyki i sulfonamidy. W miarę wzrostu zużycia antybiotyków i sulfonamidów w lecznictwie wzrastała liczba szczepów opornych.

Mueller, porównując wyniki leczenia rzeżączki w Stanach Zjedno­czonych stwierdził, że w latach 1940—1941 przy użyciu sulfonamidów można było wyleczyć około 70% pacjentów w porównaniu z 30% w la­tach 1944—1945. Kryński i wsp. stwierdzili w roku 1957, że ponad 95% gronkowców wyizolowanych z materiałów klinicznych i pozaklinicznych było opornych na sulfonamidy. W tym samym okresie w mate­riałach klinicznych szpitali woj. gdańskiego zaobserwowano około 73% szczepów gronkowców opornych na penicylinę, 35% na streptomycynę, 24% na chloramfenikol i około 12% gronkowców opornych na aureomy-cynę. W latach sześćdziesiątych nastąpiło szybkie zwiększenie oporno­ści wśród pałeczek Gram-ujemnych. Obecnie izolowane ze środowiska szpitalnego szczepy Pseudomonas aeruginosa są niemal wszystkie opor­ne na dostępne antybiotyki. Wzrósł odsetek szczepów opornych Kleb-siella pneumoniue, Escherichia coli, Flayobacterium, Enterobacter i innych pałeczek Gram-ujemnych.

Problem oporności szczepów drobnoustrojów zaczyna nabierać coraz większego znaczenia, zmuszając służbę zdrowia do intensywnego poszu­kiwania środków zaradczych. Starając się zapobiec dalszemu przyrosto­wi szczepów opornych, ogranicza się stosowanie antybiotyków do przy­padków koniecznych i tylko pod kontrolą lekarza. Ogranicza-się rów­nież wolną sprzedaż antybiotyków, stosowanie ich w kosmetyce i w ży­wieniu zwierząt. W USA i w Anglii ogranicza się liczbę stosowanych antybiotyków. Po pewnym czasie zarzuca się stosowane dotychczas antybiotyki, wprowadzając na ich miejsce nowe, dotąd nie stosowane. Innym rozwiązaniem jest wykorzystywanie uzupełniającego się działanią antybiotyków. Polega to na podawaniu np. dwóch antybiotyków równocześnie, przy czym każdy z nich działa na inne procesy komórko­we drobnoustrojów. Tego rodzaju działanie ma na celu utrudnienie roz­woju szczepów opornych. Na ograniczenie przyrostu szczepów opor­nych istotny wpływ ma stosowanie antybiotyków z jednoczesnym kon­trolowaniem wrażliwości drobnoustrojów in vitio. Szczepy wyizolowa­ne od chorego są poddawane oznaczeniu oporności na antybiotyki sto­sowane w leczeniu. Poznanie oporności szczepu pozwala zastosować antybiotyki, które powinny dać najlepszy skutek leczniczy i określa zarazem dawkę antybiotyku.

Wzrastająca częstość występowania szczepów opornych uniemożliwia lekarzowi wybór właściwego antybiotyku bez oparcia na wynikach ba­dań laboratoryjnych. Oznaczenia wrażliwości drobnoustrojów przepro­wadza się in vitro, posługując się zwykle metodami rozcieńczeniowymi lub dyfuzyjnymi.

Metody rozcieńczeniowe są dokładniejsze niż metody dyfuzyjne — umożliwiają wyrażenie stopnia wrażliwości w wartościach tzw. MIC i MBC.

MIC (minimal inhibitory concentration) — jest to najmniejsze stę­żenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustrojów.

MBC (minimal bactericidal concentration) — odpowiada najmniej­szemu stężeniu antybiotyku działającemu bakteriobójczo. Do najczęściej stosowanych metod rozcieńczeniowych zaliczamy metodę probówkową i płytkową. W metodzie probówkowej antybiotyk rozcieńcza się w do­wolnym stosunku — podłożem bulionowym o specjalnym składzie, pod­czas gdy w metodzie płytkowej używa się do tego celu upłynnionego podłoża agarowego lub innego. Badane szczepy posiewa się do odpo­wiedniego podłoża bulionowego. Wyrosłą hodowlę rozcieńcza się 1:1000 i w określonych ilościach dodaje do każdej probówki lub posiewa na powierzchni serii płytek z agarem, zawierających malejące stężenia antybiotyku. Posiane próbki są inkubowane przez 18 godzin w temp. 37°C (nie dla wszystkich drobnoustrojów), po czym dokonuje się odczy­tu. Zmętnienie lub osad w bulionie świadczy o wzroście bakterii, bu­lion przejrzysty oznacza zahamowanie rozwoju drobnoustrojów. Naj­wyższe rozcieńczenie antybiotyku, w którym nie wystąpił wzrost, przyj­mujemy za wartość MIC. Określona wartość jest tym bardziej zbliżona do rzeczywistej, im stosunek rozcieńczeń jest mniejszy. W metodzie płytkowej wartości MIC ustalamy analogicznie na podstawie określenia najmniejszego stężenia hamującego rozwój drobnoustrojów na agarze. Metoda płytkowa ma pewne zalety. Posługując się tą samą serią płytek, można oznaczyć jednocześnie wrażliwość kilkunastu szczepów, a do­danie krwi (drobnoustroje bardziej wymagające) nie utrudnia odczytu.

Metody rozcieńczeniowe nie należą jednak do metod najczęściej sto­sowanych. Przyczyną jest brak standardów antybiotyków, znaczna pra­cochłonność, konieczność posiadania dokładnych wag i sporej ilości szkła.

Dlatego w laboratoriach bakteriologicznych powszechnie stosuje się metody dyfuzyjne, w których używa się głównie krążków bibuło­wych wysyconych znaną ilością antybiotyku. Rzadko używane są w tym celu cylinderki. Zasada metody krążkowej polega na dyfuzji anty­biotyku z krążka do żelu agarowego i działaniu na komórki wysianego szczepu. Dyfundujący antybiotyk powoduje powstanie dookoła krążka strefy zahamowania wzrostu proporcjonalnej do stopnia wrażliwości szczepu (ryć. 9).

                        Krążek

                        z antybiotykiem

                        Strefa zahamo­wania wzrostu

                          Wzrost drobno­ustrojów (kolonie)

Ryć. 9. Oznaczenie wrażliwości szczepów na antybiotyki metodą dyfuzyjną za pomocą krążków bibułowych

Oznaczenia powinno się prowadzić według propozycji Komitetu Ekspertów Światowej Organizacji Zdrowia na podłożu Muellera-Hinto-na (B—12). Jałowe podłoża rozlewa się na płytki Petriego o średnicy 100 mm. Grubość agaru na płytce powinna wynosić 4 mm ± l mm. W razie potrzeby określenia wrażliwości drobnoustrojów o zwiększo­nych wymaganiach odżywczych opisane podłoże można wzbogacić przez dodanie krwi baraniej lub końskiej albo też 0,5 g glukozy, 0,5% Bacto tryptose ,,Difco" i 0,5% wyciągu drożdżowego (B—13). Płytki przed posianiem należy podsuszyć przez 30 minut w temp. 37°C. Na­stępnie przygotowuje się rozcieńczenia 18—24-godzinnej hodowli bu­lionowej badanego szczepu. Dobrze rosnące pałeczki Gram-ujemne i większość ziarniaków rozcieńcza się 1:1000. Hodowle paciorkowców, dwoinek zapalenia płuc, drożdżaków należy rozcieńczyć 1:20. Jeden ml tak przygotowanej zawiesiny przenosi się na powierzchnię podsu­szonego podłoża, zbierając nadmiar płynu pipetką. Jeżeli płyn z powie­rzchni podłoża został dokładnie usunięty, krążki układa się po 4 lub 5 na każdej płytce i po 30 minutach wstawia do cieplarki o temp. 37°C. Wstępny okres 30 minut preinkubacji w temperaturze pokojowej jest zbyt krótki dla antybiotyków wolno dyfundujących. Dlatego przy ozna­czaniu tą metodą wrażliwości na polimiksynę B i kolimycynę okres preinkubacji prowadzonej w temperaturze 4°C powinien trwać 18 godzin. Czas inkubacji w cieplarce zazwyczaj wynosi 18—24 godziny. Wyjątek stanowią drobnoustroje rosnące powoli, dla których koniecz­na jest dłuższa inkubacja. Po zakończeniu inkubacji mierzy się średnicą stref zahamowania (np. za pomocą cyrkla) i podaje w milimetrach. Rów­nolegle należy zawsze prowadzić oznaczenie wrażliwości szczepu wzor­cowego.

Pomimo prostoty oznaczania wrażliwości metodą krążkową wymaga ona bardzo starannego wykonania i przestrzegania przepisów.

Użycie niewłaściwego podłoża, zmiana wielkości posiewu, pominięcie okresu preinkubacji, inne pH, pominięcie kontroli ze szczepem wzorco­wym są często przyczynami zmiany wielkości strefy i tym samym mogą być powodem fałszywego określenia wrażliwości.

Ważny element uzyskania właściwego wyniku w metodzie krążko­wej stanowi odpowiednia zawartość antybiotyków w krążkach. Komi­tet Ekspertów postuluje użycie standardowych krążków o średnicy 6 mm i optymalnej zawartości antybiotyków (tab. 3).

Tabela 3

Zawartość niektórych antybiotyków w krążkach bibułowych zalecana przez Komitet Ekspertów (wg Kalużewskiego)