mikro_podstawowa_aparatura.pdf

MIKROBIOLOGIA ņ YWNO ĺ CI Ę WICZENIA 1

Sterylizacja i dezynfekcja to nie s Ģ synonimy!

Sterylizacja – całkowite usuni ħ cie drobnoustrojów ł Ģ cznie z formami przetrwalnikowymi.

Dezynfekcja – zniszczenie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych lub psuj Ģ cych

Ň ywno Ļę , nie musi niszczy ę przetrwalników.

Pasteryzacja – działanie na drobnoustroje temperatur Ģ poni Ň ej 100˚C.

Sterylizacja - działanie na drobnoustroje temperatur Ģ powy Ň ej 100˚C.

Upperyzacja – w przypadku mleka, momentalne ogrzanie mleka do temperatury 135-150˚C i

natychmiastowym jego ochłodzeniu.

podstawowa aparatura mikrobiologiczna

Urz Ģ dzenia do jałowienia w wysokiej temperaturze:

- autoklaw :

• metalowy kocioł

• podwójne Ļ ciany, podwójne dno, szczelna pokrywa, docisk na Ļ ruby

• system grzewczy (elektryczny lub gazowy)

• przyrz Ģ dy kontrolne (manometry, termometry, wodowskazy)

• zawór bezpiecze ı stwa

• kurek odpowietrzaj Ģ cy

• czynnik jałowi Ģ cy – przegrzana para wodna pod zwi ħ kszonym ci Ļ nieniem

• etapy sterylizacji: 1. nagrzewanie

2. sterylizacja wła Ļ ciwa temperatura na stałym poziomie

3. chłodzenie do temperatury otoczenia

• parametry: temperatura: 110-121˚C

czas: 15 – 60 minut (zale Ň y od obj ħ to Ļ ci po Ň ywki)

•

u Ň ywanie autoklawu wymaga szczególnych zasad ostro Ň no Ļ ci

•

do jałowienia po Ň ywek, sprz ħ t itp.

- aparat Kocha :

•

budowa prostsza ni Ň autoklawu

•

czynnik jałowi Ģ cy – bie ŇĢ ca para wodna o temp. 100˚C

•

do sterylizacji po Ň ywek, które nie mog Ģ by ę sterylizowane w wy Ň szej temp.

•

czas sterylizacji: 15 – 60 minut (zale Ň y od obj ħ to Ļ ci i rodzaju materiału)

•

w takich warunkach gin Ģ jedynie formy wegetatywne

•

do całkowitej sterylizacji stosuje si ħ tyndalizacj ħ (3-krotne ogrzewanie w 100˚C)

- suszarki :

•

do prac analitycznych, do jałowienia szkła laboratoryjnego

•

czynnik jałowi Ģ cy suche, gor Ģ ce powietrze

•

dla lepszych efektów temperatura: 160 – 170˚C przez 1-2 h

•

swobodny obieg powietrza

urz Ģ dzenia do hodowli drobnoustrojów

- termostat (cieplarka) :

•

urz Ģ dzenia do hodowli drobnoustrojów na po Ň ywkach

•

utrzymuj Ģ stał Ģ , okre Ļ lon Ģ temperatur ħ wewn Ģ trz komór

•

optymalna temperatura

bakterie i promieniowce – 32˚C

dro Ň d Ň e i grzyby - 28˚C

- wytrz Ģ sarki:

•

do hodowli wgł ħ bnej drobnoustrojów w warunkach tlenowych

•

do hodowli dynamicznej

•

posiadaj Ģ regulowane drgania, mog Ģ by ę poł Ģ czone z ła Ņ ni Ģ wodn Ģ

•

vortexy do pojedynczych prób

- ła Ņ nie wodne :

•

do hodowli w probówkach lub kolbkach, krótkotrwałe hodowle

•

łatwiej osi Ģ gn Ģę wymagana temperatur ħ

- anaerostaty:

•

do hodowli w warunkach beztlenowych

•

pró Ň nia lub atmosfera gazów oboj ħ tnych (N 2 , CO 2 ), lub stosuj Ģ c odpowiednie substancje

pochłaniaj Ģ ce tlen

- wirówki:

•

ró Ň ne typy, wielko Ļę , regulowane obroty, praca okresowa lub ci Ģ gła

•

do oddzielania komórek mikroorganizmów od po Ň ywki płynnej

•

3000 – 4000 obrotów

- szafy chłodnicze i zamra Ň arki:

•

do przechowywania kultur komórkowych, jałowych podło Ň y, roztworów witamin itp. w

warunkach chłodniczych

- szafy laminarne :

•

umo Ň liwiaj Ģ zachowanie jałowo Ļ ci, przeprowadzanie ró Ň nych prac mikrobiologiczncyh bez

u Ň ycia palnika

•

wyposa Ň one w filtr bakteriologiczny, nawiew powietrza

- urz Ģ dzenia do rozdrabiania prób:

•

homogenizatory, stomacher, młynki, rozdrabniacze

3. Ogólne zasady mycia oraz jałowienia szkła, sprz ħ tu, podło Ň y i powierzchni.

Szkło laboratoryjne powinno by ę czyste w sensie chemicznym i mikrobiologicznym.

Szkło nowe nie u Ň ywane – wykazuje cz ħ sto odczyn alkaliczny – gotowanie 15-30 min. w 1% HCl,

płukanie, gotowanie 30 min. w 1% Na 2 CO 3 , płukanie w bie ŇĢ cej, destylowanej wodzie.

Szkło u Ň ywane – autoklawowanie, usuni ħ cie hodowli, mycie pod bie ŇĢ c Ģ wod Ģ z detergentem,

płukanie w wodzie bie ŇĢ cej i destylowanej, suszenie w suszarce lub powietrzu.

Szkło bardzo zabrudzone i pipety w chromiance.

Sprz ħ t plastikowy – woda z detergentem.

Szkło umyte i wysuszone, owini ħ te w papier jałowi si ħ w suszarce.

Szalki Petriego, pipety dodatkowo zabezpieczone korkami z waty w ustnikach, grupuje si ħ do

jałowienia w metalowych tubusach.

Sterylizacja w suszarkach 2-4 godzin, 160˚C.

Ezy i igły przed u Ň yciem wyjaławia si ħ w płomieniu palnika gazowego.

Po Ň ywki wyjaławia si ħ w autoklawie lub w parze bie ŇĢ cej w aparacie Kocha, lub przez s Ģ czenie.

Pasteryzacja dotyczy Ļ rodków Ň ywno Ļ ciowych (mleko, piwo, moszcz owocowy)

Pomieszczenia wyjaławia si ħ promieniami UV, filtrami bakteriologicznymi.

4. Mikroskop, budowa i technika mikroskopowania.

BUDOWA MIKROSKOPU ĺ WIETLNEGO

a) cz ħĻ ci mechaniczne:

- podstawa (zawiera o Ļ wietlacz)

- statyw

- tubus

- stolik mikroskopowy

- Ļ ruba makrometryczna – zakres przesuwu kilkadziesi Ģ t mm, pełny obrót Ļ ruby przesuwa układ

o 18 mm

- Ļ ruba mikrometryczna – zakres przesuwu 2 mm, skok 0,1 mm

- pokr ħ tła Ļ rub

b) cz ħĻ ci optyczne:

- aparat o Ļ wietlaj Ģ cy (zwany aparatem Abbego) – kondensor i przysłona irysowa (diafragma),

kondensor zbudowany jest z 2-3 soczewek silnie skupiaj Ģ cych Ļ wiatło na preparacie, a w

konsekwencji na soczewce czołowej obiektywu

przesłona irysowa reguluje ilo Ļę Ļ wiatła wpadaj Ģ cego do kondensora

- o Ļ wietlenie aparatu

- obiektywy:

•

jest ich zwykle od 3 do 5, umieszczone s Ģ w tzw. rewolwerze

•

powi ħ kszenia: 5, 10, 20, 40, 60, 100 razy (opisane na obudowie)

•

zbudowany jest z kilku lub kilkunastu soczewek skupiaj Ģ cych sklejonych balsamem kandyjskim,

umieszczonych w metalowej oprawce, najbli Ň sza preparatu to soczewka czołowa

•

obiektywy suche (powietrzne) i zanurzeniowe (immersyjne)

Û obiektywy suche (5-60 razy) – du Ň e mikroorganizmy (algi, grzyby i pierwotniaki)

Û obiektywy zanurzeniowe (100 razy) – barwione preparaty bakteryjne i inne obiekty

wymagaj Ģ ce du Ň ego powi ħ kszenia

Û zasada działania

- obiektyw suchy – promienie trafiaj Ģ do o Ļ rodka optycznie rzadszego (powietrza) ulegaj Ģ w nim

załamaniu oraz odbiciu i nie wszystkie trafiaj Ģ do soczewki czołowej obiektywu

- obiektyw immersyjny – przestrze ı robocza pomi ħ dzy preparatem a soczewka czołow Ģ

wypełnia płyn immersyjny (olejek cedrowy, rycynowy), o współczynniku załamania Ļ wiatła

zbli Ň onym do szkła, promienie Ļ wietlne przechodz Ģ c przez preparat trafiaj Ģ na o Ļ rodek

optycznie jednorodny, nie nast ħ puje zatem zjawisko rozproszenia Ļ wiatła, wszystkie promienie

Ļ wietlne dochodz Ģ do obiektywu

- okulary

•

zbudowane s Ģ z soczewek płasko-wypukłych i powi ħ kszaj Ģ na zasadzie lupy

•

maj Ģ powi ħ kszenia od 2 do 30 razy

•

soczewka bli Ň ej oka to soczewka oczna, ta bli Ň ej obserwowanego przedmiotu to soczewka

polowa

•

stosuje si ħ okulary Huygensa i Ramsdena)

•

mikroskopy binokularne (dwa okulary) i monokularne (jeden okular)

•

mo Ň e by ę dodatkowa soczewka nale Ň y o niej pami ħ ta ę przy obliczaniu powi ħ kszenia

mikroskopu)

Zasada działania mikroskopu

- promienie Ļ wietlne (lusterko lub Ņ ródła Ļ wiatła sztucznego) zostaj Ģ skierowane ze Ņ ródła

Ļ wiatła poprzez aparat Abbego na preparat

- wi Ģ zka Ļ wiatła z aparatu Abbego przechodzi najpierw przez otwór przysłony irysowej, a

nast ħ pnie zostaje skupiona w soczewkach kondensora

- z kondensora Ļ wiatło przechodzi przez otwór w stoliku na preparat, przy tym przej Ļ ciu cz ħĻę

promieni ulega ugi ħ ciu na preparacie, a cz ħĻę przechodzi nie zmieniona dalej do o Ļ rodka

znajduj Ģ cego si ħ mi ħ dzy preparatem a soczewk Ģ czołow Ģ obiektywu

- promienie ugi ħ te na preparacie i promienie o Ļ wietlenia tła trafiaj Ģ do obiektywu – powstaje

pierwsze powi ħ kszenie przedmiotu (obraz rzeczywisty, powi ħ kszony i odwrócony)

- z obiektywu obraz trafia do okularu, otrzymujemy obraz powi ħ kszony, prosty i pozorny

Parametry charakteryzuj Ģ ce mikroskop:

- powi ħ kszenie mikroskopu – iloczyn powi ħ kszenia obiektywu i okularu, liczby oznaczaj Ģ ce

powi ħ kszenie wyryte s Ģ na wymienionych elementach

- zdolno Ļę rozdzielcza mikroskopu okre Ļ la, jak blisko siebie mog Ģ le Ň e ę dwa punkty, aby

patrz Ģ c na nie przez mikroskop mo Ň na je było widzie ę jako punkty oddzielne, zale Ň y ona

wył Ģ cznie od obiektywu

D = ȹ /2AN

D – najmniejsza odległo Ļę mi ħ dzy punktami

ȹ – długo Ļę fali Ļ wiatła

AN – apertura numeryczna obiektywu

apertura numeryczna – okre Ļ la zdolno Ļę układu optycznego do przyjmowania Ļ wiatła

AN = n · sin ŋ

n – współczynnik załamania Ļ wiatła Ļ rodowiska mi ħ dzy preparatem a obiektywem

ŋ – k Ģ t aperturowy utworzony przez skrajny promie ı wchodz Ģ cy do soczewki czołowej

obiektywu a jego osi Ģ optyczn Ģ

•

im krótsza jest fala Ļ wiatła i im wi ħ ksz Ģ apertur ħ liczbow Ģ posiada obiektyw, tym wi ħ ksza jest

zdolno Ļę rozdzielcza mikroskopu

•

apertura numeryczna dla obiektywów suchych – poni Ň ej 1,0

•

apertura numeryczna dla obiektywu immersyjnego - powy Ň ej 1,0 (1,2-1,6)

•

zdolno Ļę rozdzielcza dla obiektywu immersyjnego – 0,2 Ⱥ m (dł. fali 0.55 Ⱥ m)

•

zdolno Ļę rozdzielcza dla mikroskopu optycznego – 0,2 Ⱥ m

- odległo Ļę robocza – odległo Ļę pomi ħ dzy soczewk Ģ czołow Ģ obiektywu a preparatem w

momencie prawidłowego ustawienia ostro Ļ ci obrazu, w miar ħ zwi ħ kszania powi ħ kszenia

odległo Ļę robocza maleje

- przestrze ı robocza – przestrze ı pomi ħ dzy soczewk Ģ czołow Ģ obiektywu a preparatem w

chwili najlepszego widzenia

Zasady pracy z mikroskopem

- zapozna ę si ħ z budow Ģ i zasad Ģ działania mikroskopu

- mikroskop w odległo Ļ ci 15-20 cm od skraju stołu

- w osi optycznej obiektyw o najmniejszym powi ħ kszeniu, odległo Ļę 2-3 cm od stolika

- przesłona irysowa całkowicie otworzona i wł Ģ czone o Ļ wietlenie

- na stolik poło Ň y ę preparat w zaciskach

- zbli Ň y ę maksymalnie stolik do soczewki czołowej obiektywu (patrz Ģ c z boku), Ļ rub Ģ

makrometryczn Ģ ustawi ę kontur badanego preparatu, i jego obraz

- ostro Ļę ustawi ę delikatnie za pomoc Ģ Ļ ruby mikrometrycznej

- przegl Ģ da ę preparat, zmieniaj Ģ c obiektywy od najmniejszego do najwi ħ kszego powi ħ kszenia,

ale przy ka Ň dej zmianie obiektywu oddali ę najpierw obiektyw od preparatu i powtarza ę

wszystkie czynno Ļ ci j/w

- preparat w immersji – obiektyw immersyjny w osi optycznej max podniesiony do góry, na

preparat nanie Ļę kropl ħ olejku immersyjnego, patrz Ģ c z boku opuszcza ę obiektyw a Ň do

momentu zanurzenia soczewki czołowej w olejku, skorygowa ę Ļ wiatło – aparat Abbego bardzo

blisko stolika, za pomoc Ģ Ļ ruby makro pó Ņ niej mikro szuka ę obrazu preparatu, obiektyw cały

czas w olejku

- zasady porz Ģ dkowe: nie pozostawia ę resztek cieczy na soczewkach i stoliku

przykrywa ę mikroskop po sko ı czonej pracy

soczewki czy Ļ ci ę specjaln Ģ szmatk Ģ

nic samowolnie nie wykr ħ ca ę

olejek zetrze ę przy u Ň yciu Ļ ciereczki i ksylenu.

Inne typy mikroskopów

Mikroskop do ogl Ģ dania w ciemnym polu

- wykorzystano efekt Tyndalla – buduj Ģ c odpowiedni kondensor, który kieruje promienie Ļ wiatła

uko Ļ nie do powierzchni szkiełka podstawowego, promienie odbijaj Ģ si ħ od tej powierzchni i

wracaj Ģ do kondensora, a pole widzenia pozostaje ciemne; natomiast je Ļ li natrafia na obiekt

ulegaj Ģ załamaniu lub ugi ħ ciu i wpadaj Ģ do obiektywu)

- otrzymuje si ħ jasny obraz obiektu na tle ciemnego pola, komórki wygl Ģ daj Ģ jakby same

emitowały Ļ wiatło

- do obserwacji Ň ywych organizmów i ich ruchu, wida ę w nim nawet du Ň e wirusy

niedostrzegalne w zwykłym Ļ wietlnym mikroskopie

Mikroskop do ogl Ģ dania w ultrafiolecie

- fale Ļ wiatła UV s Ģ krótsze (180-400 nm)

- do ogl Ģ dania komórek o wielko Ļ ci 0,1 Ⱥ m (w Ļ wietlnym o Ļ rednicy nie mniejszej ni Ň 0,2 Ⱥ m)

- soczewki wykonane z kwarcu, który przepuszcza promienie UV

- obrazy otrzymuje si ħ na kliszy fotograficznej lub ekranie TV

Mikroskop fluorescencyjny

- zwi Ģ zki fluorescencyjne (fluorochromy) – zwi Ģ zki chemiczne absorbuj Ģ ce energi ħ fal UV i

emituj Ģ ce jako fale widzialne wi ħ kszej długo Ļ ci, mog Ģ mie ę okre Ļ lone zabarwienie w Ļ wietle

widzialnym

- nasycenie zwi Ģ zkami fluorescencyjnymi mikroorganizmów spowoduje, Ň e stan Ģ si ħ one

widoczne w o Ļ wietleniu UV

- do wykrywania pr Ģ tków gru Ņ licy czy ró Ň nicowania Ň ywych i martwych komórek

Mikroskop kontrastowo-fazowy

- do badania Ň ywych komórek dzi ħ ki zastosowaniu kontrastu fazowego bez konieczno Ļ ci

barwienia komórek

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: