Glukoneogeneza, metabolizm glikogenu, szlak pentozo-fosforanowy
Glukoneogeneza
§ Organizm ludzki dysponuje około jednodniowym zapasem glukozy. Dzienna konsumpcja glukozy wynosi ok.160±20g (75% zużywa mózg). W płynach ustrojowych jest ok. 20g gluko-zy, zapasy glikogenu mogą być zamie-nione na ok.180-200g glukozy.
§ Jeśli glukoza nie jest dostarczana w wystarczającej ilości w diecie, to jej brak uzupełniany jest na drodze syntezy (glukoneogeneza) z niewęglowodano-wych prekursorów
§ W mięśniach intensywny wysiłek prowadzi do przekształcenia pirogro-nianu powstającego w wyniku glikolizy do mleczanu (fermentacja mlekowa). Z mleczanu na drodze glukoneogenezy regenerowana jest glukoza
§ Substratami w glukoneogenezie u zwierząt są: pirogronian, mleczan, większość aminokwasów, glicerol, intermediaty cyklu TCA.
§ Nie są substratami u zwierząt kwasy tłuszczowe (dają tylko acetylo-CoA), leucyna i lizyna (w czasie ich degradacji również powstaje acetylo-CoA)
§ Acetylo-CoA może być jednym z substratów glukoneogenezy u roślin (poprzez cykl glioksalowy)
§ Glukoneogeneza u zwierząt zachodzi głównie w wątrobie (90%) i nerkach (10%)
§ Glukoneogeneza nie jest prostym odwró-ceniem glikolizy ( DG0’= - 74kJ/mol), była-by wtedy procesem endoergicznym. Glu-koneogeneza jest jednak również egzoergiczna ( DG0’= - 37.7 kJ/mol), dzięki kilku odmiennym od szlaku glikoli-tycznego reakcjom.
§ Na 10 reakcji glikolizy, 7 jest wspólnych z glukoneogenezą. Trzy kluczowe (regulu-jące glikolizę) reakcje przebiegają z udziałem innych enzymów. Alternatyw-nymi reakcjami zastąpione są glikolityczne reakcje heksokinazy, fosfofruktokinazy i kinazy pirogronia-nowej
§ Pozwala to na niezależną (od glikolizy) regulację szlaku glukoneogenezy
§ Alternatywne reakcje to: (1) konwersja pirogronianu do szczawiooctanu przez karboksylazę pirogronianową i szczawio-octanu do fosfoenolopirogronianu przez karboksykinazę fosfoenolopirogroniano-wą (DG0’ jest bliska 0), (2) konwersja fruktozo-1,6-bisfosforanu do fruktozo-6-fosforanu przez fruktozo-1,6-bisfosfatazę, (3) hydroliza glukozo-6-fosforanu do glukozy przez glukozo-6-fosfatazę
§ Konwersja fruktozo-1,6-bisfosforanu do glukozy katalizowana przez wyżej wymienione fosfatazy jest silnie egzoergiczna (DG0’=-30.5 kJ/mol) i napędza cały proces glukoneogenezy
Karboksylaza pirogronianowa zależna od biotyny
§ Katalizuje przekształcenie pirogronianu do szczawiooctanu
§ W reakcji substratem oprócz pirogro-nianu są kwaśny węglan i ATP, koenzymem jest biotyna, allosterycznym aktywatorem jest acetylo-CoA
§ Karboksylaza jest tetramerem (500 kD). Każdy monomer ma biotynę kowa-lencyjnie związaną z lizyną centrum aktywnego
§ Pierwszy etap reakcji – nukleofilowy atak tlenu z kwaśnego węglanu na g-fosfor ATP. Powstaje karbonylofosforan i ADP
§ W drugim etapie karbonylofosforan reaguje intensywnie z biotyną tworząc N-karboksybiotynę, uwalnia się fosforan
§ Trzeci etap reakcji – usunięcie protonu z kwasu pirogronowego daje karboanion reagujący z N-karboksybiotyną, co prowadzi do powstania szczawiooctanu
§ Do karboksylacji biotyny konieczne jest wiązanie acetylo-CoA (lub jego pochodnych) w miejscu allosterycznym. Regulacja acetylo-koenzymem A ma znaczenie fizjologiczne. Acetylo-CoA jest głównym substratem cyklu TCA, szczawiooctan jest ważnym związkiem pośrednim tego cyklu jak i gluko-neogenezy. Przy niskim stanie energetycznym komórki (mało acetylo-CoA i ATP) pirogronian jest kierowany do cyklu TCA, co pośrednio prowadzi do syntezy ATP. Przy wysokim poziomie ATP i acetylo-CoA pirogronian jest przekształcany w szczawiooctan, zużywany następnie w glukoneogenezie.
§ Karboksylaza pirogronianowa zlokalizo-wana jest w macierzy mitochondrialnej. Następny enzym na szlaku glukoneo-genezy – karboksykinaza fosfoenolo-pirogronianowa może występować w cytosolu, macierzy mitochondrialnej lub w obu miejscach równocześnie (jak np. w ludzkiej wątrobie). Jeśli enzym występuje w cytoplazmie, to aby przetranspor-tować jego substrat (szczawiooctan) z macierzy mitochondrialnej (błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla szczawiooctanu) trzeba go przekształcić w jabłczan, który po przejściu przez mitochondrialną błonę do cytosolu przekształcany jest ponownie w szczawiooctan.
Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa
§ Dekarboksyluje i fosforyluje szczawio-octan do fosfoenolopirogronianu (DG0’ w wątrobie jest równe –22.6 kJ/mol). Reszta fosforanowa pochodzi z GTP, który regenerowany jest z zużyciem ATP w reakcji z kinazą nukleozydodifosfo-ranową (GDP+ATPÛADP+GTP)
Fruktozo-1,6-bisfosfataza hydrolizuje fruk-tozo-1,6-bisfosforan do fruktozo-6-fosforanu (DG0’= -16.7 kJ/mol)
§ Allosteryczna stymulacja cytrynianem
§ Allosteryczna inhibicja przez fruktozo-2,6-bisfosforan i AMP
Glukozo-6-fosfataza przekształca glukozo-6-fosforan w glukozę
§ Enzym zlokalizowany jest w błonach retikulum endoplazmatycznego komórek wątroby i nerek. Nie ma go w mięśniach i mózgu (nie zachodzi tam glukoneo-geneza)
§ Hydroliza zachodzi w czasie transportu glukozo-6-fosforanu z cytosolu do retikulum endoplazmatycznego. Powstała glukoza wędruje w pęche-rzykach pochodzących z retikulum, po fuzji pęcherzyków z błoną komórkową dostaje się do krwi
§ Pośrednim związkiem jest fosfohisty-dyna z centrum aktywnego
§ DG0’= - 5.1 kJ/mol
Glukoneogeneza napędzana jest przez hydrolizę ATP i GTP
2 pirogroniany +4ATP + 2GTP +2 NADH + 2H+ + 6H2O ®
®glukoza + 4ADP + 2GDP + 6Pi + 2NAD+
DG0’ = -37.7 kJ/mol
Gdyby glukoneogeneza była prostym odwróceniem glikolizy:
2 pirogroniany + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O ®
®glukoza + 2ADP +2Pi + 2NAD+
DG0’ =+74kJ/mol
Mleczan tworzony w mięśniach jest przetwarzany w wątrobie w glukozę (cykl Corich)
§ Intensywny wysiłek może prowadzić do niedostatku tlenu w komórkach przy zwiększonym zapotrzebowaniu na energię, wypełnianym intensyfikacją glikolizy
§ Intensywna glikoliza produkuje dużą ilość NADH, który w związku z niedostatkiem tlenu nie może być regenerowany w łańcuchu oddechowym. Regeneracja odbywa się poprzez redukcję pirogronianu do mleczanu
§ Wyprodukowany w mięśniach mleczan transportowany jest z prądem krwi do wątroby. Ulega tam utlenieniu przez dehydrogenazę mleczanową do pirogronianu. Ten w glukoneogenezie ulega konwersji do glukozy
Regulacja glukoneogenezy
§ Wszystkie reakcje glikolizy i większość reakcji glukoneogenezy zachodzi w tym samym przedziale komórkowym – cytosolu. Musi więc istnieć system wzajemnej regulacji hamujący jeden proces przy intensyfikacji drugiego
§ Wzajemna regulacja zależy od stanu energetycznego komórki. Przy niskim stanie energetycznym intensyfikowana jest glikoliza. Przy dużych zapasach energii pirogronian i inne metabolity używane są do syntezy glukozy
§ W glikolizie trzy kluczowe enzymy regulują silnie egzoergiczne reakcje. Są to: heksokinaza, fosfofruktokinaza i kinaza pirogronianowa
§ W glukoneogenezie regulacja odbywa się na tych samych (ale biegnących w odwrotnym kierunku) etapach katalizowanych odpowiednio przez: glukozo-6-fosfatazę, fruktozo-1,6-bisfos-fatazę i parę karboksylaza pirogro-nianowa – karboksykinaza fosfoenolo-pirogronianowa
§ Fruktozo-2,6-bisfosforan jest stymulato-rem fosfofruktokinazy i inhibitorem fruktozo-1,6- bisfosfatazy. AMP syner-gistycznie wzmacnia efekt inhibicji. Poziom fruktozo-2,6-bisfosforanu w komórce regulowany jest przez fosfofruktokinazę-2 (PFK-2) i przez fruktozo-2,6-bisfosfatazę (F-2,6-BPaza). Obie aktywności enzymatyczne zlokalizowane są w jednej cząsteczce białkowej (przykład dwufunkcyjnego enzymu)
§ Fruktozo-6-fosforan allosterycznie akty-wuje PFK-2 i inhibuje F-2,6-BPase
§ Fosforylacja jednej z seryn tandemowego enzymu przez zależną od cAMP kinazę inhibuje aktywność PFK-2 (zwiększenie Km dla F6P) i aktywuje F-2,6-BPazę
Rozkład glikogenu i skrobi
§ Organizm ludzki metabolizuje dziennie ok. 160g węglowodanów, głównie w postaci skrobi lub glikogenu
§ Jeśli zbyt mało węglowodanów dostar-czane jest w diecie to uruchamiane są rezerwy glikogenu z wątroby i mięśni
§ Hydroliza glikogenu i skrobi prowadzona jest przez obecną w ślinie i soku trzustkowym a-amylazę (u roślin wystę-puje b-amylaza) – endoglikozydazę hydrolizującą a-(1®4) wiązania w amylopektynie i glikogenie. Enzym nie hydrolizuje wiązań glikozydowych między monosacharydami znajdującymi się w pozycji cztery lub mniej reszt od miejsc rozgałęzienia w amylopektynie czy glikogenie
§ Silnie rozgałęzione oligosacharydy powstające w wyniku działania a-amylazy noszą nazwę a-dekstryn. Są one degradowane przez enzym usuwający rozgałęzienia w wyniku dwóch reakcji: (1) usuwania trisacharydowych reszt (aktywność oligo(a1,4®1,4)glukotransfe-razowa)
(2) usuwania ostatniej reszty glukozowej rozgałęzienia (aktywność a-(1®6)gluko-zydazowa)
§ Powstałe w wyniku działania enzymu usuwającego rozgałęzienia liniowe łańcuchy degradowane są przez a-amy-lazę
§ Roślinna b-amylaza jest egzoglikozydazą hydrolizującą wiązania a-(1®4) w nierozgałęzionych fragmentach skrobi
Metabolizm glikogenu tkankowego
§ W przeciwieństwie do hydrolizy glikogenu z diety, rozkład glikogenu tkankowego podlega ścisłej kontroli
§ Zapasy glikogenu w komórkach wątroby i mięśni przechowywane są w cytosolu w postaci ziarnistości o masie od 6x106 do 1600x106 Da. Ziarnistości te zawierają enzymy syntezy i rozkładu glikogenu
Fosforylaza glikogenowa – zasadniczy enzym kataboliczny dla glikogenu. Reakcja fosforylazy polega na fosforolizie przy nieredukującym końcu łańcucha glikoge-nowego. DG0’ reakcji wynosi + 3.1 kJ/mol, ale przy stosunku [Pi] do [glukozo-1-P] bliskim 100, reakcja jest silnie przesunięta w kierunku rozkładu glikogenu i DG in vivo wynosi – 6 kJ/mol
§ Fosforoliza jest korzystna energetycznie, gdyby rozkład glikogenu przebiegał hydrolitycznie to przed włączeniem w glikolizę konieczna byłaby (wiążąca się z zużyciem ATP) fosforylacja powstającej glukozy
§ Fosforoliza rozcina wiązanie między C1 usuwanej reszty glukozy a tlenem wiązania glikozydowego, dając glukozo-1-fosforan i krótszy o jedną jednostkę glukozową łańcuch glikogenu
§ Glukozo-1-fosforan jest konwertowany przez fosfoglukomutazę do glukozo-6-fosforanu, który w mięśniach wchodzi bezpośrednio w szlak glikolityczny
§ W wątrobie glukozo-6-fosforan hydroli-zowany jest do glukozy, która eksportowana jest z prądem krwi do innych tkanek
§ Fosforylaza glikogenowa jest dimerem zbudowanym z dwóch identycznych podjednostek (97.44 kD). Z każdą podjednostką związany jest fosforan pirydoksalu (jako zasada Schiffa przez lizynę 680). Każda podjednostka zawiera centrum aktywne (w środku podjednost-ki) i allosteryczne miejsce efektorowe niedaleko miejsca kontaktu między podjednostkami. Seryna 14 w każdej podjednostce może ulegać fosforylacji. W każdej podjednostce jest też miejsce wiązania substratu (glikogenu). Kontakt między podjednostkami zapewniają helisy tworzące równoległe „wieże” (reszty 262- 278)
§ Mechanizm działania fosforylazy: ortofosforan przekazuje proton na atom tlenu związany z C4 glukozy odchodzącego z reakcji łańcucha glikogenu, pobierajac równocześnie proton z PLP. Powstały po rozerwaniu wiązania glikozydowego karbokation monomeru glukozy tworzy z ortofosforanem glukozo-1-fosforan oddając proton na PLP
§ Wiązanie jednego z substratów (Pi) przez fosforylazę ma charakter silnie kooperatywny, co pozwala na zwiększa-nie aktywności enzymatycznej w wąskim zakresie stężeń substratu. Pi jest pozytywnym homotropowym efektorem
§ ATP i glukozo-6-P (mogą być uważane za końcowe produkty przemiany glikogenu) są zwrotnymi inhibitorami fosforylazy. Zmniejszają powinowactwo enzymu do Pi (negatywne efektory heterotropowe)
§ AMP stymuluje fosforylazę glikogenową (pozytywny efektor heterotropowy)
§ Allosterycznym inhibitorem fosforylazy jest kofeina
§ W wyniku allosterycznych modyfikacji powstają dwie formy enzymu : aktywna (R) i nieaktywna (T). W formie nieaktywnej zmiana konformacji powoduje, że do centrum aktywnego wystaje ujemnie naładowana reszta Asp 283, odpychając również ujemnie naładowany substrat – Pi. W wyniku allosterycznej konwersji do aktywnej formy R Asp283 zastąpiona jest przez dodatnio naładowaną, przyciagającą Pi resztę Arg 569.
§ Allosteryczna kontrola enzymu ma znaczenie przy normalnym przebiegu procesów metabolicznych. W sytuacjach kryzysowych kontrola allosteryczna jest niewystarczająca. Regulację enzymu prowadzi wtedy kowalencyjna modyfikacja (fosforylacja Ser14). Następuje przekształcenie mniej aktywnej allosterycznie regulowanej formy b w niepoddającą się allosterycznej kontroli, bardziej aktywną formę a
§ W wyniku fosforylacji Ser14 N-końcowa część podjednostki (reszty 10-22) znajdująca się wewnątrz struktury enzymu przesuwa się na powierzchnie podjednostek uściślając ich interakcję
§ Defosforylacja enzymu prowadzona jest przez fosfobiałkową fosfatazę 1
§ Fosforylacja aktywująca fosforylazę glikogenową ma charakter kaskadowy
§ Kaskada rozpoczyna się hormonalną stymulacją cyklazy adenylowej, błonowe-go enzymu przekształcającego ATP w cykliczny 3’.5’-AMP. Wiązanie hormonu do błonowego receptora powoduje jego konformacyjną zmianę stymulującą białko G (białko wiążące GTP). Białka G są heterotrimerami (podjednostki a,b,g). Podjednostka a wiąże GTP lub GDP i ma aktywność GTP-azową. W stanie nieaktywnym kompleks Gabg ma GDP w miejscu wiążącym nukleotyd. Stymulacja kompleksem hormon-receptor powoduje dysocjację GDP i wiązanie GTP do podjednostki a. Podjednostka ta dysocjuje z kompleksu i wiąże się z cyklazą adenylową powodując jej aktywację i syntezę cAMP. GTP-azowa aktywność Ga powoduje hydrolizę GTP do GDP, co w efekcie prowadzi do dysocjacji Ga(GDP) od cyklazy i reasocjację z Gbg w nieaktywny kompleks Gabg
...
xyzgeo