WSTĘP DO CYTOGENETYKI- METODY
ROZDZIAŁ I: PRĄŻKOWANIE
§ Istnieje szereg metod barwienia chromosomów dających obraz prążkowania.
§ Techniki te pozwalają na identyfikację chromosomów oraz wykrywanie aberracji chromosomalnych.
1. PRĄŻKOWANIE G (GIEMSA)
§ „Standardowa” metoda prążkowania.
§ Trypsyna (proteoliza) + odczynnik Giemsy.
§ Powstaje wzór jasnych i ciemnych prążków.
§ Ciemne prążki: regiony bogate w A-T, późno replikujące DNA, mało aktywnych genów.
§ Jasne prążki: DNA wcześnie replikujące, liczne aktywne geny.
§ Zastosowanie: identyfikacja wszystkich chromosomów i ich aberracji.
2. PRĄŻKOWANIE R (REVERSE)
§ Liczne metody otrzymywania, np. hydroliza cieplna + odczynnik Giemsy.
§ Wzór prążków stanowi odwrotność prążków G.
§ Zastosowanie: identyfikacja wszystkich chromosomów i ich aberracji, szczególnie w regionach dystalnych.
3. PRĄŻKOWANIE Q (QUINACRINE)
§ Metoda fluorescencyjna.
§ Wzór prążków podobny do prążkowania G.
§ Zastosowanie: identyfikacja wszystkich chromosomów, wariantów morfologicznych Y, satelitów i regionów centromerowych chromosomów akrocentrycznych.
4. PRĄŻKOWANIE C (CENTROMERIC HETEROCHROMATIN)
§ Ba(OH)2 + odczynnik Giemsy
§ Wybarwieniu ulegają centromery i inne regiony heterochromatyny zawierające wysoce powtórzone sekwencje.
§ Zastosowanie: identyfikacja centromerów oraz wariantów morfologicznych heterochromatyny konstytutywnej chromosomów 1, 9, 16, Y i wszystkich chromosomów akrocentrycznych.
ROZDZIAŁ II: PRĄŻKOWANIE WYSOKIEJ ROZDZIELCZOŚCI (HIGH RESOLUTION BANDING- HRB)
§ W standardowych technikach barwienia otrzymujemy około 400 prążków (średnio 6-8Mb/prążek).
§ W HRB chromosomy są barwione w prometafazie => 800 prążków.
§ HRB staje się obecnie techniką z wyboru.
ROZDZIAŁ III: FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)
§ Chromosomy nie muszą być skondensowane.
§ W FISH-u używa się znakowanej fluorescencyjnie sondy, która hybrydyzuje z interesującym nas fragmentem chromosomu.
§ Zhybrydyzowanie sondy wykrywa się w mikroskopie fluorescencyjnym.
RODZAJE SOND
§ Sondy centromerowe:
§ sondy dla centromeru określonego chromosomu;
§ Np. szybka diagnostyka aneuploidii.
§ Sondy dla sekwencje unikatowych:
§ Sondy wykrywają sekwencje unikatowe;
§ Diagnostyka submikroskopowych aberracji (np. mikrodelecje).
§ Sondy telomerowe:
§ Sondy dla regionów telomerowych;
§ Diagnostyka małych aberracji submikroskopowych, np. delecji czy translokacji.
§ Sondy malujące chromosomy:
§ Kombinacja różnych sond dla jednego chromosomu => cały chromosom jest zabarwiony (pomalowany);
§ Identyfikacja złożonych rearanżacji;
§ Ustalanie pochodzenia dodatkowego materiału chromosomowego (np. małe nadliczbowe chromosomy markerowe lub pierścienie).
ROZDZIAŁ IV: SPECTRAL KARYOTYPING (SKY)
Używa się zestawu sond. Każdy chromosom jest malowany w unikatowy sposób.
Metoda przydatna do analizy złożonych rearnżacji, szczególnie w komórkach nowotworowych.
ROZDZIAŁ V: PORÓWNAWCZA HYBRYDYZACJA GENOMOWA (COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION- CGH)
§ Metoda używana głównie w genetyce nowotworów do identyfikacji amplifikacji i delecji genowych.
§ DNA nowotworowe jest znakowane na zielono a DNA kontrolne na czerwono.
§ Obie próbki są mieszane i hybrydyzują kompetytywnie z normalnymi chromosomami metafazowymi.
§ Amplifikacja- wzrost stosunku fluorescencji zielonej do czerwonej w danym regionie.
§ Delecja- zmniejszenie stosunku fluorescencji zielonej do czerwonej.
§ Ograniczenia metody: rozdzielczość (10Mb dla delecji i 2 Mb dla amplifikacji)
MICROARRAY CGH
§ Alternatywa dla normalnego CGH oparta na mikromacierzach..
§ Zasada podobna ale DNA testowe i kontrolne hybrydyzuje z krótkimi odcinkami DNA (DNA docelowe).
§ Używa się dwóch rodzajów DNA docelowego: cDNA lub sklonowane DNA (YAC, BAC, PAC, kosmidy).
ludi.lg