sprawozdanie z elektroforezy, gr 1 i 12.docx

Imię, nazwisko, nr grupy                                                                                                  2.03.2011

SPRAWOZDANIE  Z  SEMINARIUM

Temat: Elektroforeza żelowa białek w warunkach denaturujących.

1. Procedura przygotowania próbki do elektroforezy jednokierunkowej(SDS-PAGE):

ü      Przygotować odpowiednie rozcieńczenie do próbówek (pobrać 950 µl buforu redukującego i dodać 50 µl β- merkaptoetanolu).

ü      Tkanki odwirować przez 7 min. przy  10000 rpm.

ü      Przygotowanie prób: do próbówki dodać odpowiednie ilości badanej próbki białek oraz wcześniej przygotowanego (pkt. 1) buforu do próbek

ü      Wytrząsać na Vortex’ie przez 30 sek.

ü      Próbki ogrzewać przez 3 min w temp. 95°C

ü      Ochłodzić przez 5 min.

ü      Odwirować przez 20 sek. przy 12000rpm.

2. Przygotować bufor do elektroforezy.

ü      Do 50 ml stężonego buforu (przygotowany przez prowadzącego) dodać        450 ml wody dejonizowanej.

3. Zmontować aparaturę do elektroforezy i wypełnić przygotowanym uprzednio (pkt.2) buforem( wykonanie przez prowadzącego zajęcia).

4. Nałożyć próby białkowe, po 20µl do ‘kieszonki’.

5. Podłączyć zasilanie (przez prowadzącego ćwiczenia), elektroforezę prowadzimy przez ok. 35 min, przy zasilaniu 200 V.

6. Przygotować roztwór do wybarwiania żeli oraz roztwór odbarwiający(pod dygestorium).

ü      Roztwór do wybarwiania: W kolbie miarowej o poj. 100 ml rozpuścić 5 ml błękitu Coomassie, 40 ml etanolu, 10 ml kwasu octowego, następnie uzupełnić wodą dejonizowaną do 100 ml.

ü      Roztwór odbarwiający: w kolbie miarowej o poj. 100 ml rozpuścić 40 ml metanolu, 10 ml kwasu octowego, następnie uzupełnić wodą dejonizowaną do 100ml.

7. Odłączyć zasilanie i wyjąć żele (wykonanie przez prowadzącego zajęcia).
8. Barwić przygotowanym roztworem (pkt.6) przez ok. 1h
9. Odbarwiać przez 30 min do 1h.
10. Sfotografować żele, zanalizować wyniki, umieścić w sprawozdaniu ćwiczeń.

Żel nr. 1

Aleksandra Brzezińska: Żel I, ścieżka 2:

Porównując z wzorcem( Standard 1) wynika, że w mojej próbce znajdowało się jedno białko o masie ok. 15 kDa. W związku z tym, na podstawie tabeli z przykładowymi białkami, wnioskuję, że w mojej próbce znajdował się LIZOZYM (14 kDa)

Żel 2( zdjęcie a i B)