Zastosowanie-mitochondrialnego-dna-w-badaniach-kryminalistycznych-publikacja.pdf

Katarzyna Gawêda-Walerych

Ireneusz So³tyszewski

Zastosowanie analizy

mitochondrialnego DNA

w badaniach

kryminalistycznych – perspektywy

Analiza mitochondrialnego DNA

(mtDNA) jest rutynow¹ metod¹ sto-

sowan¹ w badaniach kryminalistycz-

nych przy ustalaniu pokrewieñstwa

oraz w badaniach ewolucyjnych, an-

tropologicznych i medycynie klinicz-

nej. Znajduje swoje zastosowanie

tam, gdzie standardowe genotypo-

wanie w oparciu o uk³ady mikrosate-

litarne STR nie jest mo¿liwe. W kry-

minalistyce takie badania wykonuje

siê w przypadku œladów biologicz-

nych o du¿ym stopniu degradacji

b¹dŸ œladów z natury zawieraj¹cych

ma³e iloœci j¹drowego DNA, takich

jak koœci, zêby czy trzony w³osów.

Ponadto niektóre sekwencje mtDNA

pozwalaj¹ na okreœlenie przynale¿-

noœci gatunkowej œladów pochodze-

nia zwierzêcego.

nymi zaletami mtDNA s¹: du¿a liczba

kopii w komórce i wy¿sza odpornoœæ

na degradacjê w porównaniu z j¹dro-

wym DNA. Uwa¿a siê, ¿e druga

z wymienionych cech wynika z koli-

stej struktury mtDNA oraz przyjmo-

wania przez niego konformacji su-

perskrêconej [8]. Cechy te pozwalaj¹

na uzyskanie wyników nawet z bar-

dzo zniszczonego materia³u, którego

analiza z wykorzystaniem uk³adów

STR j¹drowego DNA jest utrudniona

lub niemo¿liwa.

W odró¿nieniu od j¹drowego DNA

(jDNA) mtDNA nie jest zwi¹zane

z bia³kami histonowymi i nie zawiera

intronów. MtDNA koduje 13 polipep-

tydów z ok. 80 podjednostek bia³ko-

wych zaanga¿owanych w fosforyla-

cjê oksydacyjn¹ oraz 2 rRNA i 22

tRNA, co zapewnia mitochondriom

ograniczon¹ autonomiê [1]. G³ówn¹

ró¿nicê stanowi sposób dziedzicze-

nia: mtDNA dziedziczone jest wy³¹cz-

nie w linii matczynej.

Wynika to z faktu, ¿e mitochondria

obecne w plemniku zawieraj¹ce ok.

100 kopii mtDNA, po zap³odnieniu

komórki jajowej, w której jest ok.

100 000 cz¹steczek mtDNA, degene-

ruj¹ w wyniku niepoznanego dot¹d

dobrze mechanizmu [5]. Poniewa¿

mtDNA nie podlega rekombinacji se-

kwencja wszystkich krewnych w linii

matczynej jest identyczna na prze-

strzeni wielu generacji (wy³¹czaj¹c

przypadki mutacji, polimorfizmów

i zwi¹zanej z nimi heteroplazmii –

patrz dalej). Dlatego sekwencja

mtDNA traktowana jest jako pojedyn-

cze locus lub tzw. haplotyp.

Budowa mitochondrialnego DNA

Mitochondrium jest organell¹ ko-

mórkow¹ odpowiedzialn¹ za dostar-

czanie energii komórce w procesie

fosforylacji oksydacyjnej. Zawiera

ono w³asny materia³ genetyczny –

kolist¹ dwuniciow¹ cz¹steczkê mito-

chondrialnego DNA o d³ugoœci ok.

16 569 pz. [9]. Ewentualne ró¿nice

w d³ugoœci wynikaj¹ m.in. z insercji

lub delecji nukleotydów. Jedna z nici

mtDNA zosta³a nazwana ciê¿k¹ H

(od ang. heavy) ze wzglêdu na du¿¹

zawartoœæ zasad purynowych, a dru-

ga lekk¹ L (od ang. light) z powodu

du¿ej zawartoœci zasad pirymidyno-

wych. Mitochondrialne DNA ró¿ni siê

od j¹drowego DNA pod wieloma

wzglêdami (tab. 1). Z punktu widze-

nia badañ kryminalistycznych g³ów-

Tabela 1

Podsumowanie g³ównych ró¿nic miêdzy mitochondrialnym i j¹drowym DNA

The summary of basic differences between mtDNA and nuclear DNA

Cecha

mtDNA

DNA jądrowe

Lokalizacja

Mitochondria

Jądro komórkowe

Liczba kopii

50-kilku tys. kopii w komórce:

2 do 10 kopii na jedno

mitochondrium

2 kopie w komórce

Struktura

Kolista dwuniciowa cząsteczka Liniowa dwuniciowa cząsteczka

Długość

Ok. 16 569 pz

Ok. 3,2 mld pz

Procentowa zawartość

regionu kodującego i

niekodującego

Region niekodujący – ok. 7%

genomu mitochondrialnego

Region kodujący – ok. 93%

genomu mitochondrialnego

Region niekodujący – ok. 97%

genomu jądrowego

Region kodujący – ok. 3%

genomu jądrowego

Dziedziczenie

W linii matczynej

Od obojga rodziców

Źródło zmienności

Mutacje

Brak zjawiska rekombinacji

Rekombinacja

Mutacje

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

Genom mitochondrialny wyró¿nia

siê wy¿sz¹ czêstoœci¹ mutacji ni¿ ge-

nom j¹drowy. Przyczyn¹ jest, jak siê

uwa¿a, wysokie stê¿enie wolnych

rodników uwalniaj¹cych siê w trakcie

wêdrówki elektronów przez ³añcuch

oddechowy. Te bardzo aktywne cz¹-

steczki uszkadzaj¹ nieos³oniête hi-

stonami DNA i prowadz¹ do zmian

w materiale genetycznym. Powsta-

waniu zmian sprzyja dodatkowo ni-

ska wiernoœæ polimerazy replikuj¹cej

mtDNA oraz mniej sprawne ni¿ w j¹-

drze komórkowym mechanizmy na-

prawcze w mitochondriach. St¹d nie-

które regiony mtDNA ewoluuj¹ 5–10

razy szybciej ni¿ geny j¹drowego

DNA wystêpuj¹ce w pojedynczych

kopiach. Najwiêkszy stopieñ polimor-

fizmu obserwowany jest w obrêbie

tzw. regionu kontrolnego (pêtli D,

ang. D-loop) – jest to jedyny fragment

mtDNA pozbawiony genów, który jest

miejscem inicjacji transkrypcji [9]. Re-

gion kontrolny ma d³ugoœæ ok. 1100

pz, co stanowi mniej ni¿ 7% ca³ego

genomu mitochondrialnego i obejmu-

je 2 regiony hiperzmienne HV1 i HV2

(ryc. 1). Zwykle HV1 obejmuje frag-

ment na odcinku od 16024 do 16365

pz, a HV2 od 73 do 340 pz. Przedsta-

wiciele populacji afroamerykañskiej

ró¿ni¹ siê od siebie œrednio w 14 po-

zycjach nukleotydowych, a przedsta-

wiciele rasy kaukaskiej œrednio

w 8 pozycjach nukleotydowych w ob-

szarze HV1/HV2. Czasami wyró¿nia

siê tak¿e region HV3, który obejmuje

obszar od 438 do 576 pz. W obrêbie

tego regionu, od 515 do 524 pz wy-

stêpuje polimorficzne dwunukleoty-

dowe powtórzenie AC, które mo¿e

mieæ od 3 do 7 powtórzeñ i mo¿na je

Ryc. 1. Sekwencje mitochondrialnego DNA wyko-

rzystywane w badaniach kryminalistycznych. Za-

znaczono wysoce polimorficzne regiony HV1,

HV2 i HV3 (kolor niebieski) w obszarze niekodu-

j¹cym, w obrêbie HV3 wyró¿niono (kolorem ja-

snoniebieskim) dwunukleotydowe powtórzenie

AC (3–7) . W regionie koduj¹cym (kolor pomarañ-

czowy) ¿ó³tym kolorem wyró¿niono gen koduj¹cy

cytochrom b. Miejsca SNP wystêpuj¹ licznie i s¹

rozsiane wzd³u¿ ca³ej cz¹steczki mtDNA, dlatego

oznaczono jedynie przyk³adowy zestaw 11 miejsc

SNP (czerwone strza³ki) [12], wykorzystywany do

rozró¿niania haplotypów w obrêbie subhaplogru-

py H1 (wyjaœnienie w tekœcie)

Fig. 1. Mitochondrial DNA sequences used in fo-

rensic analysis. Highly polymorphic HV1, HV2

and HV3 regions from D-loop (non-coding region)

are indicated with blue colour. Within HV3 region

dinucleotide repeat of AC (3–7) is indicated with

a pale-blue colour. Shown also cytochrome b ge-

ne (yellow) within the coding region (orange).

Since SNP sites are dispersed throughout the

whole mitochondrial genome, only 11 SNP sites

are shown (red arrows), a panel that enables

specifically to distinguish between haplotypes wi-

thin sub-haplogroup H1 [12] (please find explana-

tion in the text below)

kwencjonowany przez Andersona

i wspó³pracowników w 1981 r. [2]. Se-

kwencja ta nazwana Sekwencj¹ Re-

ferencyjn¹ z Cambridge – CRS (ang.

Cambridge Reference Sequence),

stanowi standard, do którego odnosi

siê wszystkie nowo zsekwencjonowa-

ne haplotypy, wymieniaj¹c jedynie po-

zycjê nukleotydu/ów, którym/i ró¿ni¹

siê od Sekwencji Referencyjnej,

a tak¿e rodzaj polimorfizmu (insercja,

delecja, substytucja). Pozycja nukle-

otydowa nr 1 (w ³añcuchu ciê¿kim)

CRS, od której rozpoczyna siê nume-

rowanie zosta³a przyjêta arbitralnie.

W 1999 r. Andrews i wsp. [3] wprowa-

dzili poprawki do CRS i obecnie obo-

wi¹zuje Poprawiona Sekwencja Refe-

rencyjna z Cambridge (ang. Revised

Cambridge Reference Sequence).

Zjawisko heteroplazmii

Populacja cz¹steczek mtDNA wy-

stêpuj¹cych u jednego osobnika zwy-

kle jest jednorodna, tzn. ma tak¹ sa-

m¹ sekwencjê, wystêpuje wtedy ho-

moplazmia. Mo¿na jednak napotkaæ

zjawisko heteroplazmii, czyli wystê-

powania cz¹steczek mtDNA o ró¿nej

sekwencji w jednym organizmie, wy-

nikaj¹ce z ju¿ wy¿ej wspomnianej

wy¿szej czêstoœci mutacji i ich kumu-

lowania siê ze wzglêdu na niedosko-

na³e mechanizmy naprawcze. Hete-

roplazmia mo¿e byæ dwojakiego ro-

dzaju: mo¿e polegaæ na punktowej

substytucji (zamianie jednego nukle-

otydu na inny, np. T na C; ryc. 3).

Mo¿e polegaæ równie¿ na zmiennej

d³ugoœci ci¹gów jednego nukleotydu,

g³ównie cytozyny (tzw. heteroplazmia

d³ugoœci) (por. ryc. 2 A, B, C).

uznaæ za mitochondrialny odpowied-

nik sekwencji STR (ang. short tan-

dem repeat) [12].

Po raz pierwszy ca³y genom mito-

chondrialny (niæ lekka) zosta³ zse-

16189C

16193.1C

16189C

AAACCCCCCCCCC

TTTGGGGGGGGGG

AAACCCCCCCCCCC

TTTGGGGGGGGGG

Ryc. 2. A – Heteroplazmia d³ugoœci w pojedynczym w³osie polegaj¹ca na insercji dodatkowej cytozyny w pozycji 16193.1. W analizowanym w³osie obecne s¹

cz¹steczki mtDNA o sekwencji identycznej z sekwencj¹ mtDNA w innych tkankach i cz¹steczki zawieraj¹ce insercjê. B – sekwencja mtDNA z krwi obwodowej.

C – Schemat powstawania mutacji prowadz¹cych do heteroplazmii d³ugoœci traktów C (10C versus 11C)

Fig. 2. A – Length heteroplasmy in a single hair due to additional cytosine insertion in position 16193.1. In the sample there are both mtDNA sequences with

insertion, as well as sequences identical to those found in other tissues. B – mtDNA sequence from blood. C – Example of mutation leading to length hetero-

plasmy of C-tracts (10C versus 11C)

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

Druga z wymienionych postaci he-

teroplazmii jest czêstsza, a za jej przy-

stwierdzi³ wystêpowanie heteropla-

zmatycznej substytucji we krwi, a tak-

¿e we w³osach telogenowych. Ostat-

ni z wymienionych rodzajów hetero-

plazmii spotykany jest najrzadziej.

Heteroplazmia w obszarze HV1

lub HV2, polegaj¹ca na substytucji

dotyczy zwykle 1 pz, zamiany nukle-

otydów w dwóch lub trzech miejscach

wystêpuj¹ ze znacznie mniejsz¹ czê-

stoœci¹. Mo¿e ona teoretycznie wy-

st¹piæ w dowolnej pozycji sekwencji,

jednak wyró¿nia siê tzw. gor¹ce miej-

sca, gdzie heteroplazmia pojawia siê

z wiêksz¹ czêstoœci¹ [9]. Za takie

miejsce uznawana jest m.in. pozycja

16093 w regionie HV1 [20] zaznaczo-

na na ryc. 3. Wg Huhne’a [16] za he-

teroplazmiê uznaje siê sytuacjê,

w której wysokoœæ drugiego piku (re-

prezentuj¹cego dany nukleotyd na

elektroferogramie) przekracza 40%

(inne Ÿród³a podaj¹ 25%) [20] wyso-

koœci piku g³ównego, co oznacza, ¿e

stosunek dwóch sekwencji musi byæ

jak 1:2,5 (ewentualnie 1:4). Wystêpo-

wanie heteroplazmii komplikuje inter-

pretacjê sekwencjonowania obsza-

rów HV1 i HV2, jednak nie dyskwali-

fikuje wykorzystania analizy mtDNA

jako dowodu w s¹dzie. Ponadto zda-

rza siê, ¿e wystêpowanie charaktery-

stycznej heteroplazmii w dwóch ana-

lizowanych i porównywanych prób-

kach mo¿e zwiêkszyæ si³ê dowodu

w s¹dzie.

wadza siê dwukrotnie. Konieczne jest

stosowanie kontroli negatywnych

i pozytywnych procesu ekstrakcji

i amplifikacji, które pozwalaj¹ na mo-

nitorowanie zanieczyszczeñ. Mimo to

czasem, podczas analizy mtDNA, ob-

serwuje siê niski poziom zanieczysz-

czenia egzogennym DNA, jednak jest

to dopuszczalne, poniewa¿ nadal

mo¿liwe jest uzyskanie prawid³owych

wyników [4]. Badania prowadzone

nad mieszaninami wykaza³y, ¿e jeœli

domieszka egzogennego DNA stano-

wi mniej ni¿ 10% badanej próbki,

wówczas nie wp³ynie negatywnie na

interpretacjê wyniku [27].

Materia³y, z których najczêœciej

izoluje siê mtDNA, to wspomniane

ju¿ w³osy, koœci i zêby. Pozytywne

wyniki badañ uzyskuje siê z fragmen-

tu w³osa o d³ugoœci 1–2 cm, a niektó-

re laboratoria donosz¹, ¿e wystarczy

nawet 3 mm w³osa, jednak zawsze

uzale¿nione jest to od jego œrednicy

i stanu [20].

Pierwszym, bardzo wa¿nym eta-

pem badañ jest oczyszczanie pró-

bek. W³osy myje siê w detergen-

cie/etanolu, a nastêpnie w wodzie,

a tak¿e stosuje siê wstêpny etap tra-

wienia proteinaz¹ w celu usuniêcia

zewnêtrznych zanieczyszczeñ.

W przypadku koœci i zêbów dodatko-

wo szlifuje siê ich powierzchniê i pod-

daje promieniowaniu UV, a potem

mia¿d¿y na proszek.

Ekstrakcjê DNA ca³kowitego z ko-

mórki przeprowadza siê za pomoc¹

standardowych procedur, jak metoda

fenolowa czy izolacja przy u¿yciu

cheleksu. Nastêpnie wykorzystuj¹c

specyficzne startery zaprojektowane

dla regionów hiperzmiennych HV1

i HV2 (ewentualnie HV3) przeprowa-

dza siê reakcjê amplifikacji. Przy

standardowym podejœciu na ka¿dy

hiperzmienny region przypada jedna

para starterów (ryc. 4a). Najczêstsza

kombinacja starterów to

L15971/L15997 i H16401/H16410

dla HV1 oraz L15/L29 i H 408/H484

dla HV2. Liczba cykli wynosi od 30 do

62. Wiêkszoœæ laboratoriów stosuje

PCR bezpoœredni, niektóre tzw. ne-

sted PCR. Ten ostatni polega na za-

stosowaniu 2 rodzajów starterów: pa-

ry zewnêtrznej i wewnêtrznej do po-

KREW

Ryc. 3. Fragment elektoferogramu pokazuj¹cy

heteroplazmiê punktow¹ w regionie HV1. W ana-

lizowanym materiale (krew) wspó³wystêpuj¹ za-

równo cz¹steczki z cytozyn¹ w pozycji 16093, jak

i cz¹steczki z tymin¹ w tej samej pozycji

Fig. 3. Partial sequencing electropherogram sho-

wing point heteroplasmy in HV1 region. In the

analysed material (blood) there are both mtDNA

sequences with cytosine in position 16093, as

well as with thymine in the same position

czynê uwa¿a siê zjawisko œlizgania

siê polimerazy replikuj¹cej mtDNA.

Heteroplazmia d³ugoœci dotyczy naj-

czêœciej obszarów miêdzy nukleoty-

dami 16184-16193 w HV1 i 303-310

w HV2. Heteroplazmia mo¿e wystêpo-

waæ na kilku poziomach [4]:

na poziomie komórki,

na poziomie tkanki.

Heteroplazmiê obserwuje siê naj-

czêœciej we w³osach, ze wzglêdu na

niewielk¹ liczbê komórek macierzy-

stych, z których powstaje w³os, co

warunkuje jego klonalny charakter.

Dlatego miêdzy w³osami jednego

cz³owieka mog¹ istnieæ wyraŸne ró¿-

nice w mtDNA.

Bendall i wsp. [6] opisali zmienne

poziomy heteroplazmii w trzonach ró¿-

nych w³osów pochodz¹cych od tego

samego cz³owieka. W organizmie

w jednej tkance mo¿e wystêpowaæ

1 rodzaj mtDNA (homoplazmia),

a w innej tkance ró¿ne rodzaje mtDNA,

np. Sullivan [24] stwierdzi³ punktow¹

heteroplazmiê u 5 spoœród 12 w³osów

(pochodz¹cych od tego samego daw-

cy) i homoplazmiê we krwi.

W organizmie w jednej tkance mo-

¿e wystêpowaæ wiele rodzajów mtDNA

(heteroplazmia), a w innej tkance tak-

¿e ró¿ne rodzaje mtDNA, np. Wilson

[28] u jednej z badanych rodzin

Metodyka badawcza

Techniki stosowane przy analizie

mtDNA nie odbiegaj¹ znacznie od

technik stosowanych dla innych uk³a-

dów polimorficznych. Poniewa¿ pod-

stawow¹ metod¹ analizy mtDNA jest

niezwykle czu³a reakcja sekwencjo-

nowania, polegaj¹ca na okreœlaniu

kolejnoœci zasad w DNA, g³ównym

zagro¿eniem i problemem zwi¹za-

nym z analiz¹ mtDNA jest mo¿liwoœæ

wyst¹pienia kontaminacji i jej monito-

rowanie. Aby zapobiec artefaktom

wynikaj¹cym z zanieczyszczenia ma-

trycy do reakcji sekwencjonowania

stosuje siê szczególne œrodki ostro¿-

noœci, m.in. sekwencjonowaniu pod-

daje siê fragmenty z obu nici mtDNA,

a reakcjê, jeœli to mo¿liwe, przepro-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

na poziomie organelli (mito-

chondrium),

wielenia docelowego fragmentu. Do

produktu powielonego za pomoc¹

pierwszej pary starterów dodaje siê

kolejn¹ parê starterów, których miej-

sca wi¹zania znajduj¹ siê na krañ-

cach sekwencji docelowej powielonej

w pierwszej reakcji – produkt tej dru-

giej reakcji amplifikacji jest krótszy.

Metodê tê stosuje siê, aby zwiêkszyæ

specyficznoœæ reakcji i iloœæ otrzymy-

wanego produktu.

W przypadku podejrzenia, ¿e

mtDNA mo¿e byæ bardzo zdegrado-

wane (fragmenty ok. 150 pz), do am-

plifikacji ka¿dego z regionów hiperz-

miennych stosuje siê po 2 lub 4 (lub

wiêcej – zale¿nie od spodziewanego

stopnia degradacji) krótkie startery,

które amplifikuj¹ fragmenty zacho-

dz¹ce na siebie (ryc. por. 4b i c).

Wówczas uzyskiwane produkty am-

plifikacji maj¹ odpowiednio po: 250

i 140 pz (lub 80 pz) 14. Podejœcie to

stosowane jest do próbek kopalnego

DNA.

Jakoœæ i iloœæ produktów reakcji

PCR ocenia siê na 1-procentowym

zmodyfikowanej metodzie opracowa-

nej przez Fredericka Sangera w 1977

r. Polimeraza DNA wyd³u¿a komple-

mentarn¹ do matrycy niæ DNA o ko-

lejne nukleotydy zaczynaj¹c od koñ-

ca 3’ startera. W mieszaninie reakcyj-

nej znajduj¹ siê oprócz „zwyk³ych”

deoksynukleotydów, wyznakowane

fluorescencyjnie dideoksynukleotydy

(ka¿dy innym barwnikiem), które s¹

pozbawione grupy 3’OH. Przy³¹cze-

nie siê dideoksynukleotydu uniemo¿-

liwia wytworzenie wi¹zania fosfodie-

strowego z kolejnym nukleotydem

i tym samym dalsze wyd³u¿anie.

W trakcie reakcji sekwencjonowania

powstaje populacja fragmentów

o ró¿nej d³ugoœci (ró¿ni¹cych siê

o jedn¹ parê zasad) zakoñczonych

wyznakowanymi dideoksynukleoty-

dami, odpowiednio A, C, G lub T. Po

oczyszczeniu produktów reakcji se-

kwencjonowania poddaje siê je roz-

dzia³owi elektroforetycznemu na p³y-

towym lub kapilarnym sekwenatorze,

który porz¹dkuje fragmenty pod

wzglêdem ich d³ugoœci. Wzbudzone

Interpretacja wyników

W przypadku gdy sekwencje

mtDNA ze œladu biologicznego i ma-

teria³u porównawczego pobranego

od podejrzanego ca³kowicie pokry-

waj¹ siê, wówczas interpretujemy to

jako zgodnoœæ lub ¿e „nie mo¿na wy-

kluczyæ, i¿ pochodz¹ z tego samego

Ÿród³a”. Wówczas nale¿y podaæ, ile

razy uzyskany haplotyp pojawia siê

w bazie sekwencji mtDNA osób nie-

spokrewnionych.

Gdy sekwencje ró¿ni¹ siê nie-

znacznie, wówczas nale¿y spraw-

dziæ, czy ró¿nice te nie wynikaj¹ z he-

teroplazmii. W tym celu nale¿y prze-

prowadziæ szczegó³ow¹ analizê, jeœli

jest to mo¿liwe, wielu próbek porów-

nawczych np. krwi, nab³onka etc. La-

boratorium FBI w Stanach Zjedno-

czonych analizuje w takich przypad-

kach do 5 dodatkowych próbek po-

równawczych [10]. Ze wzglêdu na

czêst¹ heteroplazmiê w³osów frag-

menty w³osów ³¹czy siê, tworz¹c

1 wspóln¹ próbkê, z której izoluje siê

matryca mtDNA

HV1:16024-16365

HV2:73-340

fragmenty

∼250 pz

fragmenty

∼140 pz

Ryc. 4. Rysunek obrazuj¹cy trzy ró¿ne sposoby zaprojektowania reakcji amplifikacji regionów HV1/HV2 w zale¿noœci od spodziewanego stopnia degradacji

DNA mitochondrialnego; a) tradycyjna amplifikacja, w której z regionu HV1 i HV2 powstaje po jednym produkcie; b) po u¿yciu 2 par starterów do ka¿dego z

regionów HV1/HV2, powstaj¹ po dwa produkty; c) po u¿yciu 4 par starterów do ka¿dego z regionów HV1/HV2, powstaj¹ po cztery produkty

Fig. 4. Three different strategies of HV1/HV2 regions' amplification depending on the estimated mtDNA degradation state; a) standard strategy produces one

product from each region; b) application of 2 primer pairs for both HV1 and HV2 results in two products for each one; c) application of 4 primer pairs for both

HV1 and HV2 results in four products for each one

¿elu agarozowym, a nastêpnie pod-

daje siê je oczyszczaniu, aby pozbyæ

siê starterów. Kolejno przeprowadza

siê reakcjê sekwencjonowania ampli-

fikowanych regionów hiperzmien-

nych, z regu³y z u¿yciem takich sa-

mych starterów, jak do reakcji PCR.

Sekwencjonowanie opiera siê na

œwiat³em laserowym fluorescencyjne

barwniki emituj¹ promieniowanie

o czterech odmiennych d³ugoœciach

fali, co pozwala odró¿niæ od siebie

odpowiednie nukleotydy: A, C, G i T.

Ostatecznie uzyskujemy sekwencjê

analizowanych regionów w postaci

chromatogramu (ryc. 2 A, B; 3).

materia³ genetyczny. Jeœli porówny-

wane sekwencje ró¿ni¹ siê choæ jed-

nym nukleotydem i nie wynika to

z heteroplazmii, wówczas wynik jest

nierozstrzygaj¹cy.

W przypadku heteroplazmii d³ugo-

œci homopolimerycznych traktów nu-

kleotydowych trudne jest jedno-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

znaczne okreœlenie liczby nukleoty-

dów w takim ci¹gu, i dlatego do celów

interpretacyjnych wczeœniej zak³ada

siê, ¿e ci¹g obejmuje okreœlon¹ licz-

bê zasad.

Jeœli dwie porównywane sekwen-

cje mtDNA wykazuj¹ tak¹ sam¹ hete-

roplazmiê wówczas interpretujemy

taki przypadek jako zgodnoœæ lub ¿e

„nie mo¿na wykluczyæ, i¿ pochodz¹

z tego samego Ÿród³a”. Jeœli jedna

z próbek jest homoplazmatyczna,

a druga heteroplazmatyczna, ale jed-

na z sekwencji próbki heteroplazma-

tycznej jest taka sama jak sekwencji

homoplazmatycznej, wówczas b³ê-

dem by³oby orzeczenie wykluczenia.

Jeœli obie próbki wydaj¹ siê homopla-

zmatyczne, a ró¿ni¹ siê nieznacznie

(np. w jednej pozycji nukleotydowej),

konieczna jest powtórna analiza [10].

nentu amerykañskiego. Celem pro-

jektu by³o stwierdzenie, czy laborato-

ria stosuj¹ce ró¿ne metody i strategie

analizy uzyskaj¹ jednolite i zgodne

wyniki, a tak¿e ocena Ÿróde³ mo¿li-

wych b³êdów. Analiza projektu wyka-

za³a du¿¹ zgodnoœæ co do uzyskiwa-

nych wyników oraz znikom¹ liczbê

b³êdów i pos³u¿y³a do opracowania

wytycznych, w oparciu o które kon-

struowana jest baza mtDNA wysokiej

jakoœci [2].

Bazy populacyjne umo¿liwiaj¹ przy-

porz¹dkowanie haplotypów do okreœlo-

nych haplogrup, czyli zbiorów haploty-

pów charakteryzuj¹cych siê wspólnymi

polimorfizmami w obrêbie ca³ego geno-

mu mitochondrialnego. Np. ok. 99%

przebadanych haplotypów mtDNA dla

rasy kaukaskiej (w Europie i Stanach

Zjednoczonych) mo¿na zaklasyfikowaæ

do 10 g³ównych haplogrup: H, I, J, K,

M, T, U, V, W i X. Najczêstsz¹ haplo-

grup¹ jest grupa H, która wg danych

SWGDAM wystêpuje z czêstoœci¹

45,7%. Kolejne czêsto wystêpuj¹ce ha-

plogrupy to: U (15,6%), T (10,5%), J

(10%), i K (8,9%) [9]. W obrêbie haplo-

grup mo¿na dodatkowo wyró¿niæ sub-

haplogrupy, np. haplogrupê H mo¿na

podzieliæ na 7 subhaplogrup: H1-H7.

O przynale¿noœci do haplogrupy czy

subhaplogrupy decyduje podobieñstwo

sekwencji haplotypów, które wskazuje

na ich wspólne pochodzenie.

Najwiêkszym problemem baz da-

nych mtDNA jest jak na razie niewiel-

ka liczba zgromadzonych haploty-

pów, co mo¿e prowadziæ do uzyski-

wania zawy¿onych wartoœci czêsto-

œci danego haplotypu w populacji.

W miarê nap³ywania nowych haploty-

pów liczba sekwencji, które pojawiaj¹

siê w bazie tylko raz bêdzie siê

zmniejszaæ. Stworzenie bazy obej-

muj¹cej reprezentatywn¹ i znacz¹c¹

grupê haplotypów dla danej populacji

jest trudniejsze i wymaga wiêkszej

liczby danych ni¿ w przypadku mar-

kerów j¹drowych. Struktura populacji

mtDNA jest odmienna od populacji

uk³adów autosomalnych STR – cha-

rakteryzuje siê mniej równomiernym

rozk³adem, co mo¿e wynikaæ ze

wspomnianego ju¿ dziedziczenia

odmatczynego, braku rekombinacji,

czy tzw. efektu za³o¿yciela.

Zastosowanie

Analizê mtDNA po raz pierwszy

wykorzystano w 1996 r. w postêpo-

waniu s¹dowym w sprawie Paula

Ware’a oskar¿onego o dokonanie

gwa³tu i morderstwa 4-letniej dziew-

czynki [13]. Paul Ware – mieszkaniec

stanu Tennessee (USA) i opiekun

dziewczynki – zosta³ znaleziony nie-

trzeŸwy obok cia³a dziewczynki. Je-

dynymi œladami z miejsca zbrodni by-

³o kilka w³osów znalezionych w ³ó¿ku

i jeden ujawniony w krtani dziewczyn-

ki. Analiza porównawcza mitochon-

drialnego DNA z wybranych w³osów

i materia³u porównawczego (œlina po-

dejrzanego) wykaza³a zgodnoœæ se-

kwencji, natomiast sekwencja mito-

chondrialnego DNA z krwi ofiary by³a

odmienna. W bazie danych mtDNA

FBI (obejmuj¹cej wówczas 742 ha-

plotypy) sekwencja mtDNA od Paula

Ware’a nie wyst¹pi³a ani razu. Oskar-

¿ony zosta³ uznany za winnego za-

rzucanego mu czynu.

Dziedziczenie odmatczyne i brak

rekombinacji oznaczaj¹ce, ¿e krewni

w linii matczynej maj¹ tak¹ sam¹ se-

kwencjê u³atwia identyfikacjê osób

zaginionych b¹dŸ zw³ok lub szcz¹t-

ków N.N., polegaj¹c¹ na porównaniu

sekwencji mtDNA wyizolowanego ze

œladów biologicznych z próbkami re-

ferencyjnymi od krewnych w linii mat-

czynej.

Opracowanie metod analizy

mtDNA stwarza szansê na rozwik³a-

nie wielu aktualnie prowadzonych

spraw kryminalnych, ale tak¿e tych,

które w przesz³oœci nie doczeka³y siê

wyjaœnienia. Przyk³adem mo¿e byæ

zaginiêcie 61-letniego pacjenta

w 1979 r. w USA, który oddali³ siê

z oœrodka opieki medycznej dla wete-

ranów [8]. Mimo intensywnych po-

szukiwañ mê¿czyzny nie uda³o siê

odnaleŸæ. Ponad 10 lat póŸniej w po-

bli¿u oœrodka pies przypadkowo wy-

kopa³ czaszkê ludzk¹ i sprawê prze-

kazano do laboratorium FBI. W 1999

r. analiza mitochondrialnego DNA wy-

kaza³a zgodnoœæ profilu uzyskanego

z czaszki z sekwencj¹ pochodz¹c¹

od brata zaginionego mê¿czyzny.

Sprawê zamkniêto, og³aszaj¹c, i¿ od-

nalezione szcz¹tki nale¿¹ do zaginio-

Bazy sekwencji DNA

mitochondrialnego

Na œwiecie istnieje kilka ogólnie

dostêpnych baz danych sekwencji

mtDNA, m.in. populacyjna baza

stworzona przez SWGDAM (Grupa

Robocza ds. Metod Analizy DNA).

Dzia³a ona w oparciu o oprogramo-

wanie MitoSearch, opracowane

przez FBI, pozwalaj¹ce na przeszuki-

wanie ca³ego regionu kontrolnego

mtDNA, identyfikacjê oraz obliczenie

ile razy konkretna sekwencja pojawia

siê w bazie danych. Od 2001 r. FBI

prowadzi Program Narodowej Bazy

Danych DNA Osób Zaginionych (CO-

DISmt). Celem projektu jest groma-

dzenie profili mitochondrialnego DNA

niezidentyfikowanych szcz¹tków

ludzkich i dowodów rzeczowych przy-

datnych do ich identyfikacji, jak rów-

nie¿ materia³u referencyjnego od

krewnych (w linii matczynej) osób za-

ginionych [8]. Inna baza elektronicz-

na mtDNA (Group’s mitochondrial

DNA population database Project –

EMPOP) powsta³a z inicjatywy ED-

NAP (Europejskiej Grupy Oznacza-

nia Profili DNA). Dane nap³ywaj¹ z la-

boratoriów kryminalistycznych z ró¿-

nych pañstw. W 2003 roku przepro-

wadzono „test analizy DNA mitochon-

drialnego”, w którym wziê³o udzia³ 21

laboratoriów europejskich i 2 z konty-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 248/05

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: