MZ-TZrokII-cw2.pdf

U niwersytet W armińsko‐ M azurski w Olsztynie; K atedra M ikrobiologii P rzemysłowej i Ż ywności

P rzedmiot: M ikrobiologia Ż ywności, Ćwiczenie 2

Ćwiczenie 2

Temat: Metody badań mikroskopowych.

Morfologia komórki prokariota (bakterii).

Obserwacje mikroskopowe cech morfologicznych drobnoustrojów wymagają przygotowania

preparatu mikrobiologicznego. Preparat mikroskopowy jest to szkiełko podstawowe

(przedmiotowe) z umieszczonym na jego powierzchni materiałem biologicznym. Preparat

można wykonać z hodowli mikroorganizmów albo bezpośrednio z badanego materiału

płynnego np. mleka lub stałego np. mięsa (tzw. preparaty odciskowe).

Przygotowanie szkiełka podstawowego

Warunkiem uzyskania preparatu dobrej jakości jest oczyszczenie i odtłuszczenie szkiełka

podstawowego. Zanieczyszczenia fizyczne usuwa się z powierzchni szkiełka przez potarcie

suchą bawełnianą szmatką. Szkiełka odtłuszczamy poprzez 2-3-krotne opalenie nad

płomieniem palnika.

Wykonanie rozmazu

Rozmaz sporządza się na odtłuszczonym, wystudzonym szkiełku podstawowym przez

naniesienie i rozprowadzenie kropli zawiesiny mikroorganizmów przy użyciu ezy.

Preparaty można mikroskopować bezpośrednio po wykonaniu lub poddać je barwieniu.

Barwienie jest to proces fizyko-chemiczny polegający na wniknięciu barwnika do wnętrza

komórki mikroorganizmu i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą lub wewnątrz-

komórkowymi strukturami komórki. Barwienie ma na celu ułatwienie obserwacji cech

morfologicznych i diagnostycznych komórek mikroorganizmów np. kształtu, wielkości,

ułożenia komórek, septowania strzępek grzybni, zdolności ruchu, występowania

i rozmieszczenia wici i rzęsek, obecności otoczek, a także sposobu rozmnażania przez

podział, pączkowanie (wytwarzanie i ułożenie pączków), zarodnikowanie (ułożenie

zarodników) oraz tworzenia i rozmieszczenia form przetrwanych w komórce. Barwienie może

być również zastosowane do liczenia komórek żywych i martwych, czyli do badania

przeżywalności mikroorganizmów. Ze względu na sposób wstępnego przygotowania

preparatu wyróżniamy barwienie przyżyciowe oraz barwienie preparatów utrwalonych.

Barwienie przyżyciowe – gdy na żywe komórki mikroorganizmów naniesione na szkiełko

podstawowe działamy barwnikiem np. oznaczanie przeżywalności drożdży, które polega na

barwieniu przyżyciowym komórek drożdży barwnikiem w dużym rozcieńczeniu (błękit

metylenowy w rozcieńczeniu 1:10000). Zabarwieniu ulegają jedynie komórki martwe lub

będące w stanie subletalnym o zdegenerowanej ścianie komórkowej (barwnik łatwiej

przenika przez ścianę). Żywe komórki drożdży pozostają bezbarwne.

- 1 -

U niwersytet W armińsko‐ M azurski w Olsztynie; K atedra M ikrobiologii P rzemysłowej i Ż ywności

P rzedmiot: M ikrobiologia Ż ywności, Ćwiczenie 2

Barwienie preparatów utrwalonych – gdy barwieniu poddaje się utrwalone (martwe)

komórki drobnoustrojów. Utrwalanie polega na termicznym lub chemicznym zabiciu

mikroorganizmów i przytwierdzeniu ich do powierzchni szkiełka podstawowego. Celem

utrwalania jest ułatwienie stosowanym barwnikom penetracji przez ścianę komórkową i ich

wniknięcie do wnętrza komórki oraz odsłonięcie w ścianach komórkowych mikroorganizmów

związków, z którymi wiążą się barwniki . Chemiczna metoda utrwalania polega na

naniesieniu na wysuszony rozmaz mikroorganizmów odpowiedniego odczynnika

(np. formaliny, alkoholu, eteru). Po kilku minutach preparat wysycha i jest przygotowany do

barwienia. Termiczna metoda utrwalania polega na 2-3-krotnym przeciągnięciu szkiełka

podstawowego z wysuszonym rozmazem mikroorganizmów w płomieniu palnika. Szkiełko

podczas utrwalania powinno być zwrócone rozmazem ku górze.

Rysunek 1 – Czynności związane z przygotowywaniem preparatu mikrobiologicznego do

barwienia; A) odtłuszczanie szkiełka podstawowego; B) wykonywanie rozmazu

mikroorganizmów przy użyciu ezy; C) termiczne utrwalenie rozmazu na szkiełku

podstawowym

Ze względu na złożoność technik barwienia preparatów dzieli się je na proste i złożone.

Barwienie proste , czyli monochromatyczne (jednobarwne) polega na zastosowaniu jednego

barwnika do wizualizacji komórek mikroorganizmów (barwienie pozytywne) lub zabarwienia

tła preparatu (barwienie negatywne). Barwienie złożone , czyli polichromatyczne

(wielobarwne) polega na zastosowaniu dwóch lub więcej barwników w ściśle określonej

kolejności.

- 2 -

U niwersytet W armińsko‐ M azurski w Olsztynie; K atedra M ikrobiologii P rzemysłowej i Ż ywności

P rzedmiot: M ikrobiologia Ż ywności, Ćwiczenie 2

METODY BARWIENIA

Proste

Złożone

Barwienie jednym barwnikiem

Barwienie dwoma lub więcej barwnikami

w ściśle ustalonej kolejności

Pozytywne

Zabarwieniu ulegają komórki,

tło preparatu pozostaje bezbarwne

Zabarwieniu na różne kolory ulegają komórki,

tło preparatu pozostaje bezbarwne

Negatywne

Zabarwieniu ulega tło preparatu,

komórki pozostają bezbarwne

Pozytywno-negatywne

Zabarwieniu na różne kolory ulegają komórki

lub ich struktury oraz tło preparatu

Rysunek 2 – Podział metod barwienia

Barwienie proste pozytywne - Polega na zabarwieniu komórek mikroorganizmów w formie

utrwalonej z zastosowaniem jednego barwnika. Tło preparatu po barwieniu pozostaje

bezbarwne. W tym barwieniu zastosowanie znalazły głównie zasadowe barwniki anilinowe

(błękit metylenowy, zieleń malachitowa, zieleń brylantowa, fuksyna zasadowa, czerwień

obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy). Zasadowe barwniki wykazują silne

powinowactwo do kwaśnej cytoplazmy wewnątrzkomórkowej mikroorganizmów tworząc z nią

trwałe, barwne kompleksy.

Barwienie proste negatywne - Polega na zabarwieniu tła nieutrwalonego preparatu

z zastosowaniem jednego barwnika i powstaniu kontrastu pomiędzy wybarwionym tłem

i bezbarwną komórką. Do barwienia negatywnego zastosowanie znalazły kwaśne lub

gruboziarniste barwniki ( fuksyna kwaśna, eozyna, erytrozyna, czerwień Kongo, nigrozyna,

Kolargol, tusz chiński). Należy pamiętać, że preparat barwiony metodą negatywną nie jest

utrwalany tylko suszony w powietrzu atmosferycznym.

Barwienie złożone pozytywne – Polega na zastosowaniu minimum dwóch barwników w celu

zabarwienia komórek na różne kolory (barwienie Grama) lub zabarwienia struktur

wewnątrzkomórkowych np. przetrwalników i całych komórek (barwienie Wirtza/Schaeffer-

Fultona).

Barwienie metodą Grama – jest barwieniem różnicującym, które pozwala wyodrębnić dwie

zasadniczo odmienne grupy bakterii charakteryzujące się inną budową strukturalną ściany

komórkowej. Wyróżniamy bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie. W wyniku barwienia

metodą Grama bakterie Gram-ujemne barwią się na kolor różowy, a bakterie Gram-dodatnie

na kolor fioletowy. Jednak, żeby dokładnie zrozumieć mechanizm barwienia należy

w pierwszej kolejności zapoznać się z budową ściany komórkowej tych grup bakterii.

- 3 -

U niwersytet W armińsko‐ M azurski w Olsztynie; K atedra M ikrobiologii P rzemysłowej i Ż ywności

P rzedmiot: M ikrobiologia Ż ywności, Ćwiczenie 2

Struktura ściany komórkowej bakterii

Gram-ujemnych

Gram-dodatnich

Białka

Poryny

Kwasy lipotejchojowe

Kwasy tejchojowe

LPS

Zewnętrzna błona

komórkowa

Peptydoglikan

(mureina)

Błona

cytoplazmatyczna

Fosfolipidy

LPS - Lipopolisacharydy

Lipoproteiny

NAG – N-acetyloglukozamina

NAM – Kwas N-acetylomureinowy

Rysunek 3 – Struktura ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich.

Ściana komórkowa bakterii jest elastyczną strukturą nadającą komórce określony kształt.

Stanowi barierę ochronną przed czynnikami zewnętrznymi, jest przepuszczalna dla substancji

niskocząsteczkowych i soli mineralnych. Szkielet ściany komórkowej bakterii składa się

z polimeru – peptydoglikanu, zwanego mureiną. Peptydoglikan składa się z łańcuchów

polisacharydowych, usieciowanych przez mostki peptydowe. Każdy łańcuch polisacharydowy

zbudowany jest z N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomureinowego połączonych

wiązaniem β-1,4-glikozydowym. Białka umieszczone w zewnętrznej warstwie ściany

komórkowej różnią się w zależności od rodzaju i szczepu bakterii.

Ściana komórkowa bakterii Gram-dodatnich jest zbudowana z 40 warstw mureiny.

Chemicznie około 30-70% suchej masy ściany stanowi peptydoglikan. W strukturze

peptydoglikanu występują kwasy tejchojowe i lipotejchojowe, które wystając nad

powierzchnię warstwy mureiny tworzą cienką powłokę polisacharydową. Ścianę komórkową

bakterii Gram-dodatnich można usunąć za pomocą enzymu – lizozymu, naturalnie

występującego w łzach i błonach śluzowych jamy nosowej. Komórkę Gram-dodatnią po

usunięciu ściany komórkowej nazywamy protoplastem.

Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych składa się zaledwie z 2-3 warstw mureiny,

co stanowi około 10-20%. Otoczona jest zewnętrzną błoną złożoną z lipopolisacharydów,

fosfolipidów, lipoproteidów i białek. Fosfolipidy występują głównie w wewnętrznej warstwie

zewnętrznej błony, a lipoproteidy łączą zewnętrzną błonę z peptydoglikanem. Warstwa

lipopolisacharydowa zawiera duże ilości jonów wapnia, co czyni ją odporną na działanie

lizozymu. Komórki bakterii Gram-ujemnych o usuniętej ścianie komórkowej nazywamy

sferoplastami.

- 4 -

U niwersytet W armińsko‐ M azurski w Olsztynie; K atedra M ikrobiologii P rzemysłowej i Ż ywności

P rzedmiot: M ikrobiologia Ż ywności, Ćwiczenie 2

Zasada barwienia metodą Grama

Rysunek 4 – Barwienie metodą Grama.

1) Fiolet krystaliczny jest zasadowym, słabo rozpuszczalnym barwnikiem, który

w roztworze tworzy kationy. Łatwo penetruje przez ścianę komórkową i błonę

cytoplazmatyczną bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich wnikając do wnętrza

komórki. Na tym etapie wszystkie komórki wybarwione są na fioletowo.

2) Następnie na preparat nanosi się płyn Lugola , który stanowi roztwór jodu w jodku

potasu. Jony jodu łatwo przenikają do wnętrza komórki, podobnie jak cząsteczki fioletu

krystalicznego. Kationy barwnika reagują z jonami jodu tworząc wielkocząsteczkowe,

nierozpuszczalne w wodzie kompleksy. Wszystkie komórki nadal zabarwione są na kolor

fioletowy.

3) Trzeci etap polega na naniesieniu odbarwiacza (roztworu alkoholu lub mieszaniny

acetonu z alkoholem). Odbarwiacz wnika w warstwy mureiny bakterii powodując

dehydratację. W wyniku usunięcia wody następuje zagęszczenie sieci mureiny, a tym

samym zmniejszenie pustych przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych.

Ponadto w wyniku działania odbarwiacza u bakterii Gram-ujemnych zniszczeniu ulega

zewnętrzna błona lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny. Kompleks

barwnika z jodem zostaje uwięziony pod zwartą i grubą warstwą mureiny w komórkach

bakterii Gram-dodatnich, natomiast z komórek bakterii Gram-ujemnych jest on łatwo

wymywany odbarwiaczem. Na tym etapie następuje właściwe zróżnicowanie komórek.

Komórki Gram-dodatnie z uwięzionym kompleksem barwnika nadal mają zabarwienie

fioletowe, podczas gdy komórki Gram-ujemne stają się bezbarwne po wypłukaniu

kompleksu.

4) Ostatnim etapem jest dodatek barwnika kontrastowego – safraniny . Barwnik ten,

podobnie jak fiolet krystaliczny, wykazuje charakter zasadowy, słabo rozpuszcza się

w wodzie, a w roztworze tworzy kationy, które łatwo penetrują poprzez warstwę mureiny

i łączą się z ujemnie naładowanymi cząsteczkami takimi jak kwasy tejchojowe, peptydy

czy główki fosfolipidów. Ponieważ kolor safraniny jest mniej intensywny niż fioletu

krystalicznego komórki Gram-dodatnie pozostają fioletowe . Bezbarwne komórki Gram-

ujemne zabarwione safraniną przyjmują kolor różowy .

- 5 -

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: