Enzymy restrykcyjne.doc

I Część teoretyczna

1. Plazmidy

1.1 Charakterystyka plazmidów

  Plazmidy są małymi, pozachromosomowymi replikonami, a więc cząsteczkami DNA, które są zlokalizowane w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Ich replikacja jest całkowicie niezależna od replikacji chromosomu bakteryjnego. Większość z nich to kowalencyjnie zamknięte, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, jednak istnieją formy liniowe. Bakteria może posiadać bardzo dużą liczbę kopii plazmidów.

  Cechą charakterystyczną każdego plazmidu jest liczba kopii jego cząsteczek przypadająca na komórkę. Ogólna zasada mówi: im mniejszy jest plazmid, tym szybciej ulega replikacji i tym szybciej ich liczba w komórce bakterii rośnie.

W komórce bakteryjnej może występować nie tylko wiele kopii tego samego plazmidu, ale także kilka różnych plazmidów. Mówimy wtedy, że są to plazmidy zgodne.

  Plazmid może się replikować jedynie w komórce gospodarza, gdyż w procesie replikacji korzysta z białek kodowanych przez geny chromosomowe. Pewne plazmidy zwane episomami mają zdolność do wbudowywania się do chromosomu gospodarza i w takich warunkach ich replikacja odbywa się pod kontrolą chromosomu. Jest to stan przejściowy, zintegrowany plazmid może wyciąć się z chromosomu, przechodząc w formę autonomiczną.

  Istnieją nieliczne plazmidy, w cząsteczce których znajduje się więcej niż jedno miejsce inicjacji replikacji. Są to replikony złożone.

  Podział ze względu na sposób replikacji plazmidowego DNA:

· plazmidy pod ścisłą kontrolą – replikacja plazmidowego DNA przebiega równolegle z replikacją genomowego DNA, plazmidy te są z reguły dużych rozmiarów: większe od 30 MDa (większe od 45 kbp) i występują w komórce              w niskiej liczbie kopii (1÷5);

· plazmidy pod luźną kontrolą (relaxed control plasmids) – replikacja plazmidowego DNA jest niezależna od genomowego DNA, plazmidy te są mniejsze niż plazmidy pod ścisłą kontrolą (poniżej 7 MDa, czyli poniżej 10 kbp) ale za to występują w komórce w większej liczbie kopii (powyżej 20).

  Plazmid zawiera jedynie małą liczbę genów, które nie występują w chromosomie bakteryjnym, a przekazują bakterii dodatkowe cechy, np. odporność na antybiotyki, oporność na jony metali ciężkich i promieniowanie UV, zdolność do produkcji enterotoksyn.

  Ze względu na zawarte w plazmidach geny i właściwości jakie nadają komórce gospodarza zidentyfikowano 5 rodzajów plazmidów:

· plazmidy typu R, które zawierają geny oporności na antybiotyki,

· plazmidy typu F, które umożliwiają przenoszenie genów między komórkami bakteryjnymi w czasie koniugacji,

· plazmidy bakteriocynogenne zawierające geny kodujące kolicyny (białka wydzielane pozakomórkowo) które zabijają lub hamują pokrewne szczepy bakterii. Substancje te nazywamy bakteriocynami. Wytwarzane przez E. coli noszą nazwę kolicyn, Bacillus- menacyn.

· plazmidy degradacyjne, są nośnikami genów kodujących enzymy aktywne w degradacji związków organicznych np. plazmid OCT umożliwia degradację alkanów, CAM-kamfory, TOL-toluenu. Są szeroko rozpowszechnione u Pseudomonas

· plazmidy wirulencji, które nadają bakteriom zdolność do wywoływania niektórych chorób

np.plazmid Hly warunkujący wytwarzanie hemolizyny u E. coli

Właściwości warunkowane przez plazmidy:

· zdolność do koniugacji

· oporność na antybiotyki

· oporność na jony metali ciężkich

· oporność na ultrafiolet

· wytwarzanie antybiotyków

· wytwarzanie bakteriocyn

· degradacja złożonych związków organicznych

· wytwarzanie enterotoksyn

· pigmentacja

  Ich rozmiary sięgają  od 2 do około 100kb. Istnieją również tzw. megaplazmidy, których wielkość osiąga kilkaset kb. O plazmidach występujących w jednej lub w dwóch kopiach mówi się, że mają małą liczbę kopii i nazywa się je plazmidami typu stringent. Plazmidy mające dużą liczbę kopii, 10 lub więcej, nazywa się plazmidami relaxed. Plazmidy były pierwszym typem wektora opracowanym na potrzeby klonowania i stosowanym od lat siedemdziesiątych.

  Wektor jest to najczęściej cząsteczka, wirus, plazmid lub sztuczny chromosom, który służy do wprowadzania obcego DNA do komórki inne gospodarza.

Wektory stosowane są między innymi w:

· klonowaniu i amplifikacji sekwencji DNA

· badaniu mechanizmów ekspresji sekwencji DNA

· wprowadzaniu genów do komórek bakteryjnych lub organizmów wyższych

Dobry wektor powinien charakteryzować się następującymi cechami:

· musi być zdolny do niezależnej replikacji razem fragmentem DNA, który został w niego wbudowany

· powinien posiadać szereg miejsc specyficznych, a każde z nich powinno być przecinane przez jeden enzym

· powinien zawierać markery pozwalające na wyselekcjonowanie komórek, do których wniknął

· powinien być łatwo wykrywalny w komórce gospodarza

· obecność wektora nie powinna zakłócać funkcji komórki gospodarza

· powinien pozostawać w niezmienionej postaci niezależnie od liczby podziałów komórki

macierzystej

Jedną z technik służącą namnażaniu DNA jest klonowanie DNA. Klonowaniem DNA nazywa się wyodrębnianie i namnażanie fragmentów DNA za pośrednictwem wektorów, którymi są z reguły cząsteczki plazmidów lub wirusów. Proces klonowania jest wieloetapowy. Pierwszym etapem klonowania jest wycięcie własnej sekwencji DNA  za pomocą enzymów restrykcyjnych, następnym zaś wprowadzenie sekwencji DNA do wektora, takiego jak plazmid. Wektor z kolei wprowadzamy do komórek  biorcy.

  Celem umożliwienia wbudowania do kolistego wektora fragmentu obcego DNA wektor musi zostać przecięty w jednym miejscu (ulega otwarciu). DNA poddawany klonowaniu zostaje pocięty tą samą restryktazą. W ten sposób na końcach wektora, jak również klonowanego DNA, powstają jednoniciowe zakończenia komplementarne, mające tendencję do spontanicznego łączenia się ze sobą, w wyniku czego powstają cząsteczki hybrydowe.

Przygotowany, przecięty wektor oraz fragmenty Obcy DNA, który ma być włączony, również poddaje się trawieniu e DNA z „lepkimi końcami” mieszane są in vitro i w obecności ligazy łączą się ze sobą tworzą cząsteczki hybrydowe przeznaczone do wbudowania w komórki gospodarza. Znanych jest kilka metod wprowadzania wektora do komórki gospodarza:

· transformacja jest to zmiana genetycznych właściwości komórki bakteryjnej spowodowana pobraniem DNA wyizolowanego z innej komórki i włączeniem go do komórki bakteryjnej

· transfekcja jest to wprowadzanie do komórek eukariotycznych DNA wirusowego bez osłonek białkowych przy pomocy wektora

Najczęściej wykorzystywanym w manipulacjach genetycznych gospodarzem jest bakteria

E. coli. Transformowane bakterie wysiewa się na szalki z agarem, na którym będą rosły kolonie bakteryjne złożone z komórek zawierających zrekombinowany plazmid. Poszczególne kolonie przenosi się na pożywkę płynną i namnaża. Z otrzymanych hodowli można wyizolować duże ilości plazmidu i uzyskać ilość klonowanego DNA wystarczającą  do dalszych badań.

1.2 Izolacja plazmidowego DNA

  Istnieje kilkanaście metod oczyszczania plazmidowego DNA. Jedną z najpowszechniej stosowanych technik oczyszczania plazmidowego DNA jest metoda lizy alkalicznej zaproponowana przez Birnboima i Doly w 1979 roku. Obejmuje ona trzy etapy:

· hodowlę bakterii

· lizę bakterii,

· oczyszczanie plazmidowego DNA

We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:

· DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu,

·podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed circle).

Przed rozpoczęciem preparatyki należy najpierw otrzymać komórki organizmu, z którego będziemy izolować plazmidowe DNA. Namażanie może nastąpić na dwóch rodzajach podłoży:

· podłoże minimalne: podłoża minimalne mają różny skład w zależności od szczepu bakterii, ale zawsze zawierają tylko składniki niezbędne do życia danego organizmu. Przykładowo, podłoże minimalne dla E. coli zawiera: glukozę (jedyne źródło węgla), Na2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, NaCl, MgSO4 i CaCl2 – z tych substancji bakteria syntetyzuje sobie wszystkie potrzebne jej do życia związki.

· podłoże pełne zawiera wszystkie związki, których bakteria może potrzebować, także te bardzo złożone. Co ważne – dokładny skład podłoża pełnego jest nieznany. Składa się ono bowiem w większości z ekstraktów z hodowli drożdżowych i bakteryjnych – ich skład jest nieokreślony ilościowo ani jakościowo, jednak wiadomo, że zawierają komplet związków potrzebnych bakteriom do życia. Podłoża pełne są uniwersalne (takie same dla różnych szczepów bakterii).

  Komórki zostały pobrane z wcześniej wysianej na podłożu stałym kultury i przeniesione do pożywki płynnej LB z dodatkiem ampicyliny (dla plazmidów pUC, pAT,) i tetracykliny (dla plazmidów pBR, pACYC). Antybiotyk dodajemy w celu otrzymania  komórek bakterii zawierających plazmid oporności na dane antybiotyki. Po dobowej inkubacji komórki zostały odwirowane, a następnie zawieszone w buforze TGE Tris-HCl, glukoza, EDTA pH 8,0). Funkcje poszczególnych składników:

· Tris-HCL – utrzymywanie stałego lekko zasadowego pH,  a także zapobieganie agregacji komórek bakterii

· glukoza  - przeciwdziałanie szokowi osmotycznemu

· EDTA (wersenian disodowy) pełni podwójną rolę, a mianowicie:

- hamuje działanie deoksyrybonukleaz, poprzez chelatację jonów magnezu które są niezbędne do zachowania ich aktywności (deoksyrybonukleazy są enzymami, które mogą ciąć plazmidowe DNA)

- zmniejsza stabilność ściany komórkowej bakterii poprzez wiązanie jonów wapnia (jony wapnia stabilizują warstwę lipopolisacharydową wchodzącą w skład ściany komórkowej bakterii gramujemnych)

W następnym etapie ma miejsce uwolnienie kwasów nukleinowych z wnętrza komórek.

Dezintegrację komórek prowadzi się w zależności od rodzaju komórek i tkanek, np. poprzez homogenizację (miękkie tkanki zwierzęce), sonifikację (zawiesiny komórek), rozcieranie (komórki roślinne, bakteryjne), lizę detergentami (komórki z hodowli komórkowej), lizę enzymatyczną (komórki bakteryjne, drożdżowe)

Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych lub wysokiej temperatury. Stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii.

W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH (12-12,5) zawierający NaOH i dodecylosiarczan sodu (SDS) powoduje całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA zostaje zdenaturowany w niewielkim stopniu.  Rozpoczyna się również liza RNA. Uwolnienie  treści komórek powoduje, że mieszanina w probówce wykazuje dużą lepkość. Neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan potasu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu. Właśnie ta odmienność w renaturacji po obniżeniu pH jest celem metody lizy alkalicznej i pozwala na łatwe oddzielenie tych dwóch rodzajów DNA. Następnym etapem jest wirowanie w celu oddzielenia plazmidowy DNA od reszty struktur. W supernatancie oprócz interesującego nas plazmidowego DNA znajdują się również: RNA i białka i lipidy.

Następnym etapem oczyszczania DNA jest oddzielenie DNA od związanych z nim białek (tzw. odbiałczanie). Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztworem fenolu lub mieszanina fenol/chloroform. Fenol denaturuje pozostające w lizacie białka. Chloroform ułatwia rozdzielenie faz wodnej i organicznej. Ekstrakcja ta usuwa pozostałe po lizie alkalicznej białka i lipidy. Białka denaturują się i zbierają na granicy faz. Hydrofobowe lipidy umiejscawiają się w fazie organicznej. Postępowanie to prowadzi do inaktywacji i usunięcia enzymów obecnych w środowisku DNA Mieszaninę po ekstrakcji odwirowano, uzyskując dwie fazy: wodną zawierającą izolowane przez nas plazmidowe DNA oraz fazę organiczną z białkami i lipidami. Faza wodna z obu probówek została przeniesiona do nowej probówki, do której dodano alkohol izopropylowy. Jego zadaniem jest wytrącanie kwasów nukleinowych. Próbę ponownie  odwirowano, usunięto supernatant. Zbieramy górną - wodną frakcję w której znajduje się DNA i dodajemy alkoholu izopropylowego, który wspomaga ten proces i usuwa resztki chloroformu i fenolu. Następnie po odwirowaniu otrzymany osad rozpuszczono w 0,1M octanie sodu i 3M chlorku sodu oraz  zimnym 96% etanolu po czym mieszaninę pozostawiono w temp. - 20°C przez 20 min. Chlorek sodu powoduje odwodnienia otoczki hydratacyjnej i ma miejsce  koagulacja kwasów nukleinowych, które są wytrącane etanolem. Mieszanina została odwirowana, a otrzymany osad ponownie poddano działaniu etanolu w celu wytrącenia pozostałych kwasów nukleinowych. Próbę ponownie odwirowano, a osad został wysuszono w suszarce próżniowej celem odparowania reszty etanolu. Suchy osad rozpuszczono w buforze TE (Tris i EDTA).

Ostatnim zanieczyszczeniem jest RNA, który usunięty zostaje za pomocą rybonukleazy. Jest to enzym degradujący RNA poprzez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych, nie wymaga obecności jonów magnezu i jest stosunkowo oporny na wysoką temperaturę. Pod wpływem działania RNAzy powstają krótkie fragmenty kwasu, które podczas ekstrakcji z mieszanina fenol/chloroform obecne są w fazie wodnej. Po dodaniu zimnego rozpuszczalnika organicznego (etanolu) dochodzi do usunięcia otoczki solwatacyjnej, w wyniku czego fragmenty DNA tworzą agregaty i wypadają z roztworu w postaci osadu. Następnie osad plazmidowego DNA suszymy i rozpuszczamy w buforze TE. Schemat preparatyki plazmidowego DNA przedstawia poniższy rysunek.

           Rys. 1. Preparatyka plazmidowego DNA

2. Enzymy restrykcyjne

  Enzymy restrykcyjne (restryktazy) są to endonukleazy tnące DNA w specyficznych miejscach. Enzymy te zostały odkryte w komórce bakteryjnej przez W. Arbera, D. Nathansona i O.H. Smitha w 1970 r.

Enzymy te odpowiedzialne są za zjawisko restrykcji (ograniczania), skąd pochodzi ich nazwa. W warunkach naturalnych enzymy te występują w komórkach bakterii i sinic i pełnią tam rolę  systemu obronnego. Ich zadaniem jest niszczenie obcego DNA, który wtargnął do wnętrza komórek. Własny DNA mikroorganizmu nie jest niszczony przez restryktazy dlatego, że nie ma w nim specyficznych rozpoznawalnych przez restryktazę sekwencji zasad, albo miejsca takie są zmetylowane i w ten sposób stają się niedostępne dla enzymu.

  Do chwili obecnej poznano kilkaset enzymów restrykcyjnych. Ustalono również międzynarodową symbolikę służącą do oznaczania tych enzymów. Pierwsza duża litera pochodzi od nazwy rodzaju bakterii, z którego wyizolowano endonukleazę. Dwie następne litery odpowiadają gatunkowi bakterii, z którego wyizolowano enzym. Następnie umieszcza się cyfry rzymskie, przedstawiające kolejność odkrycia enzymu u tego samego gatunku bakterii.

W zależności od sposobu przecinania DNA enzymy te podzielono na 3 typy:

· enzymy typu I: po rozpoznaniu specyficznej sekwencji zasad, enzym przesuwa się wzdłuż helisy DNA, zatrzymując się w odległości od 1000 do 5000 par zasad od rozpoznanego miejsca i przecina obie nici DNA w tym samym miejscu, uwalniając jednocześnie fragment złożony  z kilkudziesięciu nukleotydów

· enzymy typu II: po rozpoznaniu specyficznej sekwencji enzym tnie obie nici DNA w miejscu rozpoznanej sekwencji. Długość rozpoznawanych sekwencji wynosi od 4 do 8 par zasad. Charakterystyczna właściwością  rozpoznawanych sekwencji jest palindromiczność, co oznacza, że kolejność zasad w jednej nici DNA odczytywana w kierunku 5’®3’ jest taka sama, jak kolejność zasad w drugiej nici w kierunku 5’®3’. Jedynie ten typ enzymów znalazł zastosowanie w inżynierii genetycznej

· enzymy typu III: enzymy tej klasy przecinają nici DNA podobnie jak enzymu typu II

  Enzymy restrykcyjne typu II mogą przecinać podwójną nić DNA na dwa różne sposoby:

· przecinają obie nici DNA na tej samej wysokości (naprzeciw siebie) tak, że powstają zakończenia DNA z tępymi końcami (blunt ends), na których nie ma wolnych niesparowanych zasad. Fragmenty DNA o tępych końcach mogą się połączyć z sobą jedynie za pomocą enzymu ligazy polinukleotydowej T4.

·  przecinają każdą nić DNA nie naprzeciwko siebie, ale cięcia na dwóch niciach przesunięte są jedno względem drugiego o kilka zasad. Powstają w ten sposób tzw. „lepkie końce”

(sticky ends), na których znajdują się niesparowane zasady. Końce takie mogą tworzyć wiązania wodorowe zgodnie z zasadą komplementarności z lepkimi końcami innego fragmentu DNA powstałego w wyniku działania tej samej endonukleazy.

Przykłady sekwencji nukleotydowych rozpoznawanych i przecinanych przez restryktazy

3. Elektroforeza

  Elektroforeza jest techniką polegająca na umieszczeniu cząsteczek kwasów nukleinowych, np. w żelu agarozowym znajdującym się w polu elektrycznym. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA przemieszczają się w kierunku dodatniej elektrody, a szybkość ich ruchu zależy od długości fragmentów badanych kwasów nukleinowych. Po odpowiednim zabarwieniu żelu można ocenić, jaka jest długość fragmentów kwasów nukleinowych obecnych w roztworze poddawanym elektroforezie....