Otrzymywanie ekstraktów enzymatycznych z materiału biologicznego.doc

POLITECHNIKA ŚLĄSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii

Otrzymywanie ekstraktów enzymatycznych z materiału biologicznego

Prowadzący:  mgr inż. Agata Ptaszek

Opracowała: mgr inż. Agata Ptaszek

CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia jest uzyskanie enzymu tyrozynazy z trzech naturalnych źródeł: pieczarki, banana i ziemniaka oraz oznaczenie wydzielonego białka metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie.

PODSTAWY TEORETYCZNE:

Wykonanie szybkiej i wydajnej izolacji enzymu wymaga spełnienia kilku podstawowych

warunków:

A.    Wybór dobrego źródła enzymu (tkanki roślinne, zwierzęce, komórki mikroorganizmów), przy zwróceniu uwagi na:

·         łatwość i wydajność separacji interesującego enzymu

·         dostępność oraz koszt uzyskania surowca

·         właściwości otrzymywanego enzymu (np. enzymy o dużej termostabilności musimy izolować najczęściej z organizmów termofilnych)

Obecnie coraz częściej w celu uzyskania potrzebnych białek doprowadza sie do ich nadprodukcji w komórkach bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach komórek ssaczych. Otrzymane w ten sposób białka nazywane są białkami rekombinowanymi. Zaletą tych technik jest możliwość otrzymania dużej ilości potrzebnego białka, a jego oczyszczanie do homogenności jest stosunkowo proste.

B.    Zachowanie warunków pozwalających na otrzymanie enzymu bez utraty jego aktywności katalitycznej, tj. :

·         utrzymanie odpowiedniej temperatury (najczęściej ok. 0oC) i pH (najczęściej w granicach 5-9),

·         ograniczenie denaturacji powierzchniowej (tj. pienienia roztworów) oraz

inaktywacji przez metale ciężkie

·         zabezpieczenie przed działaniem proteaz

·         zapewnienia wysokiej czystości pracy, aby nie doprowadzać do wtórnego

zanieczyszczenia proteazami i innymi substancjami hamującymi aktywność

Dla każdego enzymu powinno sie zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne. Pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje sie w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak: degradacje ścian komórkowych przez lizozym, rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego, sonifikację (pękanie komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradźwiękami) oraz homogenizacje, rozcieranie z piaskiem lub perełkami szklanymi i inne metody mechaniczne. Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają sie procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy.

Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo różnorodne i ich stosowanie zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia enzymu.

Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:

·         frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)

·         ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).

Metody te opierają sie na odciąganiu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworzą białka (w tym enzymy). Ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi rożne ilości grup kwasowych i zasadowych, ich rozpuszczalność zależy od stężenia rozpuszczonej soli, polarności i pH rozpuszczalnika oraz temperatury. Dlatego pewne białka wypadają z roztworu, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny. Przez odpowiedni dobór stężenia soli odwadniających można przeprowadzić ich stopniowe wytracanie, np. odwodnienie globulin nastąpi już przy 50 %-wym wysyceniu roztworu siarczanem amonu, a albumin dopiero przy całkowitym wysyceniu roztworu siarczanem amonu. Mieszające sie z wodą rozpuszczalniki organiczne, takie jak etanol czy aceton, obniżają zdolność działania wody jako rozpuszczalnika, dzięki czemu bardzo dobrze strącają białka. Mieszaninie z wodą w różnych proporcjach pozwalają na wybiórcze strącanie białek. Proces ten należy prowadzić w temperaturze 0oC lub niższej, ponieważ w wyższych temperaturach nastąpi ich denaturacja.

Otrzymane osady białkowe oddzielane są metodami filtracji lub wirowania. Następnie są rozpuszczane, a w przypadku wykorzystywania procesów wysalania mogą być poddawane dializie.

Dializę stosuje sie w celu usunięcia niskocząsteczkowych związków (np. soli) z roztworu białka, umieszczonego wewnątrz półprzepuszczalnej membrany. Na zewnątrz znajduje się roztwór o niskiej sile jonowej. Niskocząsteczkowe substancje, dążąc do wyrównania ciśnień osmotycznych po obu stronach membrany dializacyjnej, migrują przez nią do otaczającego roztworu.

Kolejnymi etapami, stosowanymi dla dalszego oczyszczania preparatów enzymatycznych, mogą być:

·         chromatografia

·         elektroforeza

·         ultrawirowanie

Tyrozynaza (EC 1.14.18.1) jest enzymem należącym do klasy oksydoreduktaz. Jest on enzymem szeroko rozpowszechnionym w organizmach żywych. Obecność tego enzymu stwierdza się zarówno w mikroorganizmach, jak i w komórkach roślinnych. Natomiast w organizmach ssaków największą aktywność tyrozynazy wykrywa się w melanocytach, ponieważ jest to metaloenzym glikoproteinowy uczestniczący w procesie melanogenezy, w wyniku którego jest produkowana melanina barwnik nadający charakterystyczne zabarwienie skóry.

Enzym ten aktywowany jest promieniowaniem UV. Do aktywacji tyrozynazy jest niezbędny aminokwas tyrozyna oraz niektóre jony.

W procesie melanogenezy tyrozynaza (hydroksylaza tyrozynowa, HT), katalizuje ortohydroksylację tyrozyny do L-DOPA, a następnie zostaje ona przekształcana w dopaminę poprzez dekarboksylazę DOPA (AADC). Dopamina może być następnie wykorzystana do syntezy noradrenaliny i adrenaliny w reakcjach katalizowanych przez hydroksylazę dopaminową (DBH) oraz N-metylotransferazę fenyloetanoloaminową (PNMT) (rys 1.).

Rysunek 1. Schemat biosyntezy amin katecholowych w organizmie ludzkim

WYKONANIE ĆWICZENIA:

Sprzęt:

·         lejek oraz bibuła filtracyjna

·         mikser

·         wirówka

·         zlewki

·         probówki typu eppendorf na 1.5 ml i typu Falcon na 15 ml

Materiały i odczynniki:

·         100 g świeżych pieczarek/bananów/ziemniaków

·         nasycony roztwór (NH4)2SO4 (4.1 M w 25° C)

·         0.1M buforu cytrynianowego o pH 4.8

·         0.1M NaF

·         lód

PRZYGOTOWANIE BUFORU CYTRYNOWEGO (PH 3.0–6.2, PKA = 6.40)

A: 0.1 M Kwas cytrynowy (M= 192.12 g/mol) ; B: 0.1 M Cytrynian sodu (M=214.12 g/mol)

X ml A + Y ml B  i dodać 50 ml H20

Procedura:

A.    Otrzymywanie enzymu z preparatów roślinnych

1.     ...