immobilizacja drożdży.doc

ĆWICZENIE 8

Immobilizacja drożdży

Prowadzący:               mgr inż. Michał Jadwiński
                            mgr inż. Przemysław Hahn

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest immobilizacja drożdży piekarskich w alginianie wapnia metodą sieciowania.

PODSTAWY TEORETYCZNE

Enzymy są biokatalizatorami, które charakteryzuje:

- wysoka specyficzność działania

- kierunkowość działania

- zdolność do obniżania w istotny sposób energii aktywacji reakcji chemicznych. Dzięki temu znalazły szerokie zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, kosmetycznego, chemicznego i w analityce medycznej. Często jednak stosowanie enzymów w formie natywnej wiąże sie z wysokimi kosztami prowadzenia procesów, szczególnie wtedy gdy konieczne jest stosowanie preparatu enzymatycznego o wysokim stopniu oczyszczenia, jak np. w farmacji, a także wówczas gdy proces prowadzony jest cyklicznie. Dlatego od lat 60-tych XX wieku coraz większym zainteresowaniem cieszą się enzymy immobilizowane.

              Immobilizacją, czyli inaczej unieruchomieniem (łac. Immobilia – nieruchomy), można określić zespół metod, które ograniczają całkowicie lub częściowo swobodę poruszania się określonych atomów, cząsteczek, substancji lub materiału biologicznego (enzymów, mikroorganizmów) na podłożu stałym czy też wewnątrz specyficznych struktur.

              Obecnie jest kilka klasyfikacji metod unieruchamiania. Najpopularniejsza z nich wyróżnia:

              - unieruchamianie na powierzchni nośnika,

              - unieruchamianie wewnątrz nośnika,

              - unieruchamianie bez nośnika.

Unieruchamianie na powierzchni

              Unieruchamianie na powierzchni nośnika występuje, gdy komórki wykazują naturalną skłonność przylegania do pewnych powierzchni lub innych organizmów, ewentualnie czynią to po zastosowaniu odpowiedniego chemicznego czynnika wiążącego (Tabela 1).

Tabela 1

W obrębie tej grupy metod wyróżnia się adsorpcję, adhezję i wiązanie kowalencyjne komórek. Ważne jest wysokie powinowactwo komórek do nośnika zapobiegające nadmiernym stratom populacji, szczególnie podczas szybkiego przepływu strumienia substratu w bioreaktorze.

Adsorpcja i adhezja polegają na unieruchamianiu komórek na powierzchni poprzez wiązania wodorowe, oddziaływania sił van der Waalsa, jonowe, hydrofobowe, elektrostatyczne, powinowactwa lub kombinacje różnych sił. Taki sposób immobilizacji jest bardzo prosty i tani, jednak ma podstawowe wady – stosunkowo niskie stężenie biomasy na jednostkę objętości bioreaktora oraz skłonność do desorpcji komórek w wyniku zmian pH, stężenia jonowego i innych czynników. Jako nośników używa się różnych materiałów: drewna, celulozy, jonitów, polimerów syntetycznych, szkła porowatego, spieków ceramicznych, tlenków metali, ziemi okrzemkowej i innych. Z kolei wiązanie kowalencyjne polega na utworzeniu chemicznych wiązań peptydowych, estrowych lub innych między nośnikiem i grupami funkcyjnymi zewnętrznej ściany komórkowej drobnoustroju. Jako czynnik wiążący stosuje się aldehyd glutarowy, natomiast nośnikami są różne materiały (szkło, ceramika, karboksymetyloceluloza, akrylany i inne). W przypadku unieruchamiania organizmów, takich jak drożdże Saccharomyces cerevisiae, kluczową rolę w wiązaniu odgrywają oddziaływania jonowe między nośnikiem o dużej gęstości ładunków dodatnich, a licznymi ujemnymi ładunkami na ścianie komórkowej drożdży. Aby zwiększyć zdolność unieruchamiania, sugeruje się zredukowanie siły elektrostatycznego odpychania komórka-nośnik. Ewentualnie dąży się do nadania powierzchni komórki lub nośnika ładunku dodatniego, przez zastosowanie np. polietylenoiminy (PEI) lub aldehydu glutarowego. Modyfikacja nośnika musi być jednak indywidualnie dobierana do unieruchamianych organizmów, ponieważ dodatek czynników aktywnych może powodować redukcję żywotności komórek lub na przykład obniżenie ilości otrzymywanego etanolu. Wiązanie drożdży można zwiększyć także w wyniku dehydratacji powierzchni komórkowej. Dehydratacja może być wynikiem suszenia konwekcyjnego lub liofilizacji, co jest związane z niszczeniem fragmentów struktury komórkowej. Następuje zwiększenie przepuszczalności błon komórkowych i 10-30% składników wewnątrzkomórkowych przedostaje się do otaczającego podłoża, wchodząc w interakcje z powierzchnią nośnika. W zależności od rodzaju użytego nośnika ilość unieruchomionych komórek jest różna, co wskazuje że immobilizacja zależy od struktury chemicznej nośnika. Natomiast wydajność adsorpcji drobnoustrojów zależy od ich rodzaju, metabolizmu i wieku oraz cech środowiska. Sposób unieruchamiania jest bardzo prosty i polega na tym, że do roztworu z namnożonym materiałem biologicznym wprowadza się nośnik i pozostawia na pewien czas, bez mieszania lub z mieszaniem, w celu osadzenia się komórek. W drugim sposobie bioreaktor wypełnia się nośnikiem i wtłacza od góry lub od dołu, namnożone na podłożu płynnym komórki.

Unieruchamianie wewnątrz nośnika

              Drugi rodzaj immobilizacji polega na „zamykaniu” komórek w materiałach włóknistych lub porowatych. W metodzie tej wyróżnia się pułapkowanie oraz zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych (Tabela 2).

Tabela 2

Pułapkowanie (inkluzja) to unieruchamianie w matrycy żelu, która najczęściej jest w kształcie kuleczki o średnicy 0.3-3 mm, ale może być w formie sferycznej czy dysków. Najpowszechniej stosowany nośnik to: alginian, poza tym stosuje się kappa-karagenian, chitozan, agar, pektynę, żywice epoksydowe, poliakryloamid.

Alginian jest kopolimerem kwasu ß-D-mannurowego i α-L-guluronowego, uzyskanym metodą ekstrakcji z brązowych alg Phaeophyceae. W obecności kationów dwuwartościowych (jak Ca2+) kwas alginianowy tworzy porowaty żel, idealny do kolonizacji i uzyskania dużego stężenia biomasy w nośniku. Matrycę polimeru uzyskuje się przez żelowanie w łagodnych warunkach, co umożliwia zamknięcie komórek z minimalną utratą ich aktywności. Najpowszechniej stosowana technika to zawieszanie komórek w alginianie sodu i wkraplanie tej mieszaniny do roztworu chlorku wapnia. W ten sposób otrzymuje się porowate kulki z uwięzionym biokatalizatorem, biomasą mikroorganizmów lub białkiem enzymatycznym (rys.1)

rys. 1

Zamykanie komórek w żelach nie eliminuje ich ucieczki do fermentowanego podłoża, ponadto, w przypadku drożdży, zachodzi pękanie kuleczek pod wpływem powstającego podczas fermentacji CO2. W celu ograniczenia tego zjawiska prowadzono m.in. badania nad utwardzaniem kuleczek alginianu wapnia polietylenoiminą i aldehydem glutarowym, karagenianu chlorkiem potasu, a kuleczek żelatyny utlenioną skrobią.

W immobilizacji wewnątrz nośnika wykorzystuje się również półprzepuszczalne membrany, przez które dyfundują małocząsteczkowe produkty i substraty, natomiast niemożliwa jest migracja cząsteczek biokatalizatora. Biokatalizatory albo zamyka się we wnętrzu kapsułki, która imituje naturalne błony biologiczne, wówczas mówimy o mikrokapsułkowaniu, albo biokatalizator jest oddzielony od środowiska przegrodą membranową w postaci płaskiej „foli” lub w postaci kapilary. W przypadku mikrokapsułkowania stosuje się membrany nylonowe, silikonowe, liposomowe, a także wytwarzane z pochodnych celulozy, a przegrody membranowe otrzymuje się na bazie polimerów, takich jak polichlorek winylu czy polipropylen. Ten sposób unieruchamiania jest jednak rzadko stosowany w przypadku żywych komórek, częściej zamykane są enzymy.

Unieruchamianie bez pomocy nośnika

W obrębie tej grupy metod wyróżnia się następujące sposoby:

– sieciowanie przestrzenne,

– flokulacja komórek przy udziale elektrolitów,

– naturalna flokulacja (samoagregacja) oraz wzrost drobnoustrojów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy.

Sieciowanie polega na wiązaniu ze sobą komórek drobnoustroju różnymi reagentami, zdolnymi do reakcji z grupami funkcyjnymi ich ściany komórkowej. Czynnikami sieciującymi mogą być aldehyd glutarowy, chlorek cyjanurowy lub heksametylenocyjaniany. Wzajemne sieciowanie jest techniką łatwą i tanią. Daje zazwyczaj dość trwały biomateriał, jednak może prowadzić także do częściowej utraty aktywności i utrudniać dyfuzję substratów. Metoda ta jest zalecana raczej do procesów z użyciem substratów małocząsteczkowych.

Flokulacja definiowana jest jako zdolność komórek będących w zawieszeniu do tworzenia większych skupień i konglomeratów w postaci kłaczków, które ulegają szybkiej sedymentacji. Procesy flokulacji pozwalają utrzymać wysoką gęstość populacji drobnoustrojów w bioreaktorze, bez stosowania nośników i innych materiałów. Przyspieszenie procesu samoagregacji można spowodować poprzez regulację pH, skład pożywki, stężenie rozpuszczonego tlenu i inne czynniki (np. dodatek polielektrolitów).

Cechy nośników stosowanych do immobilizacji

W metodach immobilizacji ważny jest właściwy dobór nośnika i techniki immobilizacji, ponieważ decydują one o aktywności unieruchomionego biokatalizatora oraz wydajności procesu technologicznego. Uważa się, że dobry nośnik powinien wykazywać następujące cechy:

- obojętność w stosunku do zatrzymywanych mikroorganizmów,

- prostota i łagodność unieruchamiania,

- duża zdolność zatrzymywania komórek,

- wysoka mechaniczna stabilność,

- obojętność chemiczna,

- duża zdolność dyfuzyjna w stosunku do substratu i produktu,

- możliwość regeneracji i kilkakrotnego użycia,

- łatwa dostępność, niski koszt,

- możliwość zastosowania w skali przemysłowej.

Zalety i wady immobilizacji

Zastosowanie komórek immobilizowanych stwarza korzyści technologiczne oraz ekonomiczne w porównaniu z tradycyjnymi procesami wykorzystującymi komórki wolne. Do korzyści tych można zaliczyć:

- wydłużenie aktywności i stabilności biokatalizatora, ponieważ nośnik może działać ochronnie w przypadku...