skrypt_badamyDNA.pdf

Badamy DNA

Agata Rogowska, Jakub Urbański

Opracowanie merytoryczne treści zestawu:

Agata Rogowska, Jakub Urbański

Ilustracje:

Dean Madden

Korekta:

Joanna Lilpop

Zestaw opracowany w ramach projektu „Science of Modern Biology –

Exploratory Resources for Biology Teachers and Students” inansowanego

przez UNESCO.

Autorzy pragną serdecznie podziękować wszystkim osobom, które

przyczyniły się do powstania zestawu, w szczególności współpracownikom

Szkoły Festiwalu Nauki, Fundacji BioEdukacji oraz instytucjom

założycielskim Szkoły Festiwalu Nauki: Międzynarodowemu Instytutowi

Biologii Molekularnej i Komórkowej, Instytutowi Biochemii i Bioizyki PAN,

Instytutowi Biologii Doświadczalnej PAN, Szkole Głównej Gospodarstwa

Wiejskiego.

Osobne podziękowania należą się dyrektorowi MIBMiK, panu Profesorowi

Jackowi Kuźnickiemu.

Niniejsze materiały podlegają licencji Creative Commons:

Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne-Bez utworów zależnych 2.5 Polska.

1 4 3

Niniejsze materiały wolno kopiować i rozpowszechniać wyłącznie niekomercyjnie w celach edukacyjnych,

pod warunkiem umieszczenia na kopiach logo Funacji BioEdukacji i Szkoły Festiwalu Nauki oraz informacji

o autorach. Nie zezwala się na zmiany ani przekształcenia niniejszego skryptu. W przypadku innych

zastosowań lub zmian materiałów niezbędna jest zgoda Fundacji BioEdukacji (www.bioedukacja.org.pl).

Szkoła Festiwalu Nauki

Struktura i funkcja DNA

Kwas deoksyrybonukleinowy - DNA (skrót od angielskiego d e ox y r ib o n ucl eic a cid )

jest podstawowym nośnikiem informacji genetycznej u wszystkich organizmów prokario-

tycznych, eukariotycznych, archeonów i niektórych wirusów. W podwójnej nici DNA zapisane

są, przekazywane od tysięcy pokoleń, informacje o budowie i czynnościach życiowych

organizmów. Łańcuch DNA zbudowany jest tylko z czterech rodzajów cząsteczek – nukleo-

tydów, w skład których wchodzą zasady azotowe: g uanina (G), c ytozyna (C), a denina (A) i

t ymina (T). To właśnie sekwencja tych zasad w łańcuchu DNA ma fundamentalne znacze-

nie dla życia na naszej planecie. Sekwencję DNA można przyrównać do książki napisanej

czteroliterowym alfabetem, kolejne zdania tej książki – geny, zapisane są we wspólnym dla

wszystkich organizmów języku – uniwersalnym kodzie genetycznym. Każde trzy litery w

sekwencji genu odpowiadają jednemu znakowi – aminokwasowi. Jak łatwo policzyć, liczba

wszystkich możliwych trzyliterowych kombinacji zapisanych czteroliterowym alfabetem

wynosi 4 3 , a więc 64. Teoretycznie więc dałoby się zakodować 64 aminokwasy - ponieważ

jednak białka wszystkich organizmów żywych zbudowane są z dwudziestu aminokwasów,

niektórym aminokwasom przypisane może być kilka trzyliterowych kodonów. Oprócz tego

istnieją także oznaczające koniec genu kodony stop – można przyrównać je do kropek koń-

czących zdanie. Każdemu kodonowi kodującemu aminokwas odpowiada jedna cząsteczka

tRNA z komplementarnym antykodonem. tRNA, czyli transportowe RNA, bierze udział w

translacji i służy jako „przenośnik” aminokwasów.

Kod genetyczny jest uniwersalny - z kilkoma drobnymi odstępstwami, te same kodony

kodują te same aminokwasy u wszystkich organizmów żywych i wirusów. Organizmy różnią

się jednak częstotliwością wykorzystania poszczególnych kodonów – wynika to pośrednio

ze składu nukleotydowego DNA. Wiadomo, że u organizmów o niskiej zawartości par G:

C w genomie, kodony bogate w G i C wykorzystywane będą rzadziej niż kodony bogate

w A i T.

Tabela 1. Uniwersalny kod

genetyczny.

* W RNA uracyl odpowiada

tyminie – stąd U zamiast T

w tabeli.

UUU fenyloalanina

UUC fenyloalanina

UUA leucyna

UUG leucyna

UCU seryna

UCC seryna

UCA seryna

UCG seryna

UAU tyrozyna

UAC tyrozyna

UAA STOP

UAG STOP

UGU cysteina

UGC cysteina

UGA STOP

UGG tryptofan

CUU leucyna

CUC leucyna

CUA leucyna

CUG leucyna

CCU prolina

CCC prolina

CCA prolina

CCG prolina

CAU histydyna

CAC histydyna

CAA glutamina

CAG glutamina

CGU arginina

CGC arginina

CGA arginina

CGG arginina

AUU izoleucyna

AUC izoleucyna

AUA izoleucyna

AUG metionina

ACU treonina

ACC treonina

ACA treonina

ACG treonina

AAU asparagina

AAC asparagina

AAA lizyna

AAG lizyna

AGU seryna

AGC seryna

AGA arginina

AGG arginina

GUU walina

GUC walina

GUA walina

GUG walina

GCU alanina

GCC alanina

GCA alanina

GCG alanina

GAU kwas asparaginowy

GAC kwas asparaginowy

GAA kwas glutaminowy

GAG kwas glutaminowy

GGU glicyna

GGC glicyna

GGA glicyna

GGG glicyna

Niektóre aminokwasy kodowane są przez kilka różnych kodonów. Jeżeli chcemy wpro-

wadzić gen z jednego organizmu (np. gen kodujący ludzkie białko) i chcemy uruchomić jego

ekspresję w innym organizmie (np. w bakterii) musimy sprawdzić, czy kodony wykorzystane

w genomie ludzkim są równie często wykorzystywane w genomie bakteryjnym. Jeśli nie

są, to przed przystąpieniem do klonowania warto wprowadzić w sekwencji DNA zmiany

(precyzyjnie zlokalizowane mutacje), które nie wpłyną na sekwencję aminokwasową, ale

zamienią rzadziej używane przez bakterie kodony na „lepsze”.

Przyjrzyjmy się bliżej DNA. Ma on strukturę dwuniciową, nici skręcone są w helisę.

Każda z nici zbudowana jest z połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi nukleotydów.

Na nukleotyd składa się zasada azotowa – puryna lub pirymidyna, cząsteczka cukru

– pentozy, w wypadku DNA jest to deoksyryboza, oraz reszta kwasu fosforowego. Reszta

kwasu fosforowego łączy się w łańcuchu DNA z pierścieniem cukru kolejnego nukleotydu.

www.sfn.edu.pl

Badamy DNA

Puryny

Rys. 1. Wzory zasad

azotowych wchodzących w

skład kwasów

nukleinowych: DNA i RNA

Pirimidyny

W związku z tym pojedyncza nić DNA wykazuje polaryzację - na jednym jej końcu zwanym

końcem 5’ znajduje się wolna reszta kwasu fosforowego, na drugim zaś, zwanym końcem

3’, wolna cząsteczka deoksyrybozy. Nici DNA połączone są wiązaniami wodorowymi między

parami zasad. Zgodnie z regułą komplementarności pirymidyna zawsze łączy się z puryną

– odpowiednio adenina z tyminą (dwoma wiązaniami) i cytozyna z guaniną (trzema wiąza-

niami). Aby mogło dojść do wytworzenia wiązań wodorowych między zasadami, nici DNA

muszą być względem siebie odwrotnie spolaryzowane – koniec 3’ jednej nici odpowiada

końcowi 5’ drugiej.

Podwójną helisę porównać można do skręconej spiralnie drabinki sznurowej, szczeble

drabinki odpowiadałyby kolejnym parom zasad, podczas gdy sznury boczne stanowiłyby

odpowiednik łańcuchów pentozofosforanowych.

Dzisiaj strukturę DNA zna chyba każdy. Aż trudno uwierzyć, że poznano ją dopiero w

drugiej połowie XX wieku. Jej model zaproponowali w 1953 roku naukowcy James Watson,

Francis Crick, Maurice Wilkins i Rosalind Franklin – pierwszych troje nagrodzono za to od-

krycie Nagrodą Nobla w 1962 roku, Rosalind Franklin nie było dane dożyć tego momentu.

Bez wątpienia było to jedno z najważniejszych odkryć w historii ludzkości. Umożliwiło

zrozumienie zasad zapisu informacji genetycznej i zapewniło dynamiczny rozwój genetyki

i biologii molekularnej. W niespełna pół wieku od rozwikłania struktury DNA genetyka

stała się jedną z najważniejszych gałęzi współczesnej nauki.

Łączna długość DNA każdej komórki somatycznej ludzkiego ciała wynosi około 2,5 me-

tra. Biorąc pod uwagę rozmiary komórki trudno uwierzyć, że tak długi łańcuch może się

tam zmieścić. Jest to możliwe dzięki upakowaniu DNA. Chromosomalne DNA występuje

w postaci chromatyny. Strukturę DNA eukariotycznego stabilizują silnie konserwowane

ewolucyjnie białka zasadowe – histony. Sekwencja aminokwasowa histonów jest niemal

identyczna u wszystkich organizmów eukariotycznych – histon H4 grochu różni się od

analogicznego histonu krowy tylko dwoma spośród 102 aminokwasów!!! Chromatyna

zbudowana jest z powtarzających się jednostek strukturalnych – nukleosomów. W skład

nukelosomu wchodzi oktamer histonowy – struktura złożona z ośmiu podjednostek biał-

kowych (po dwie cząsteczki histonów H2A, H2B, H3 i H4) oraz owinięta wokół niego nić

DNA o długości 200 par zasad. Nawinięcie na rdzeń histonowy pozwala na blisko 7-krotne

skrócenie wymiarów liniowych nici DNA. Kolejnym poziomem upakowania DNA jest solenoid

– helikalna struktura o średnicy 36 nm, złożona z nukleosomów. Na każdy obrót solenoidu

przypada 6 nukleosomów. Solenoidy z kolei upakowane są w struktury wyższego rzędu,

stabilizowane białkami niehistonowymi.

Ciekawostką jest, że najsilniej upakowane DNA znajduje się w plemnikach – tam białka

histonowe zastąpione są bogatymi w argininę protaminami.

W komórkach prokariotycznych DNA chromosomalne upakowane jest dzięki obecno-

ści zasadowych białek histonopodobnych, zbliżonych właściwościami chemicznymi do

histonów.

Kolejna ważna różnica między DNA prokariotycznym i eukariotycznym przejawia się nie

na poziomie struktury, ale sekwencji kodującej geny. U organizmów eukariotycznych sek-

Rys. 2. Model strukturalny

helisy DNA

Szkoła Festiwalu Nauki

wencje kodujące (czyli te, na podstawie których powstaje mRNA, a później białko)

w obrębie jednego genu rozdzielone są sekwencjami niekodującymi. Fragmenty

kodujące nazywamy egzonami, a niekodujące intronami. Po syntezie pierwotnego

transkryptu RNA dochodzi do tzw. splicingu (czyt. splajsingu), w wyniku którego z

egzonów składane jest mRNA. U organizmów prokariotycznych geny pozbawione

są intronów – pierwotny transkrypt – mRNA, stanowi już gotową matrycę do

syntezy białka. Różnica ta ma duże znaczenie, jeżeli chcemy syntetyzować sklo-

nowane białka eukariotyczne w bakteriach – do bakterii musimy wprowadzić gen

eukariotyczny ze zmodyikowaną, czyli pozbawioną intronów sekwencją.

Genom człowieka

Informacja genetyczna organizmów eukariotycznych zapisana jest w genomach:

jądrowym, mitochondrialnym oraz chloroplastowym (u roślin). Ludzki genom ją-

drowy ma długość około 3 miliardów par zasad i jest podzielony na 24 cząsteczki

zwane chromosomami. 22 z nich to chromosomy autosomalne (autosomy), nato-

miast pozostałe, X i Y to chromosomy płci. Każda komórka somatyczna ludzkiego

ciała zawiera 23 pary chromosomów (22 pary autosomów oraz 2 chromosomy X

– w wypadku kobiet lub X i Y u mężczyzn). Szacuje się, że w genomie jądrowym

kodowanych jest od trzydziestu do pięćdziesięciutysięcy genów, które stanowią

zaledwie 2 % sekwencji jądrowego DNA. Reszta genomu to sekwencje niekodujące,

o nieznanej funkcji.

Mitochondrialny genom człowieka jest wielokrotnie mniejszy od jądrowego.

Liczy 16 569 par zasad, koduje 37 genów. Należy pamiętać, że w każdej komórce

znajduje się wiele mitochondriów, a każde mitochondrium może zawierać do 10

cząsteczek mtDNA.

Rys. 3. Porównanie

wysokości człowieka i

długości cząsteczki DNA

z jednej komórki.

Sekwencje powtórzone

Powszechne jest występowanie w genomie ludzkim sekwencji powtórzonych. Są to sek-

wencje rozproszone po całym genomie, zwykle niekodujące. Stanowią nawet do 20% całego

ludzkiego genomu. Istnieje kilka klas sekwencji powtórzonych - każda z klas charakteryzuje

się odmienną strukturą. Jedną z klas tych sekwencji są sekwencje satelitarne.

Na ogół są to zblokowane, wielokrotnie powtórzone, krótkie sekwencje nukleotydowe.

Można je przyrównać do sznura korali nanizanych na nitkę, przy czym każdy koralik może

zawierać od 1 do nawet 100 nukleotydów. W zależności od tego jaka liczba nukleotydów

przypada na jeden „koralik” wyróżniamy sekwencje minisatelitarne (10-100 nukleotydów)

lub mikrosatelitarne (1-10 nukleotydów).

Rys. 4. Sekwencje

powtórzone w DNA

CAG

sekwencja

mikrosatelitarna

sekwencja

minisatelitarna

CAGATGGATCTAGC CAGATGGATCTAGC

Podobnie jak geny, każda sekwencja powtórzona ma swoje „miejsce” w genomie, czyli

locus (l.mn. loci). Jeżeli weźmiemy dwie dowolne osoby i będziemy szukali w ich DNA kon-

kretnej sekwencji nukleotydowej, wszystko jedno czy jest to sekwencja kodująca (gen), czy

sekwencja niekodująca to, o ile nie doszło u którejś z tych osób do zaburzenia struktury

chromosomów, z pewnością znajdziemy szukaną sekwencję w obrębie tego samego frag-

mentu tego samego chromosomu (czyli w locus).

www.sfn.edu.pl

Badamy DNA

Jak już wspomniano, sekwencje powtórzone to zwykle sekwencje niekodujące. Zatem

występowanie w ich obrębie mutacji nie pociąga za sobą konsekwencji dla funkcjonowania

organizmu, a mutacje kumulują się, są utrwalane i przekazywane kolejnym pokoleniom.

Sekwencje powtórzone są więc polimoriczne (różnorodne).

Oznacza to, że każda sekwencja powtórzona może występować w populacji ludzkiej w

kilku lub nawet kilkunastu wariantach (allelach). Polimorizm sekwencji powtórzonej może

polegać np. na zmianie ilości powtórzeń, czyli liczby „koralików” nanizanych na nitkę.

Obecnie znanych jest bardzo wiele różnych sekwencji powtórzonych i ich loci.

ALLEL A

3 powtórzenia

Rys. 5. Przykładowe allele

sekwencji satelitarnych

ALLEL B

5 powtórzeń

ALLEL C

6 powtórzeń

Sekwencja minisatelitarna DS80

Każdy poznany gen ma swoja nazwę. Nazwa zwykle pochodzi od nazwy białka, które

powstaje na podstawie tego genu, funkcji którą owo białko pełni lub charakterystycznych

cech budowy białka lub genu. Sekwencje niekodujące natomiast nazwy zawdzięczają

swojemu położeniu w obrębie genomu. I tak, sekwencja powtórzona D1S80 znajduje się na

krótszym ramieniu pierwszego chromosomu (1 oznacza pierwszy chromosom, a S krótkie

ramię – od ang. short )

D1S80 jest sekwencją powtórzoną, polimoriczną, niekodującą. Jednostka powtórzenia

- „koralik”, zawiera 16 nukleotydów, jest to wobec tego sekwencja minisatelitarna. W po-

pulacji ludzkiej występuje 29 wariantów (alleli) tej sekwencji, ponieważ liczba „koralików”,

czyli jednostek powtórzenia, może mieścić się w granicach od 14 do 43. Ciekawostką jest,

że nie stwierdzono występowania u ludzi allelu o 15 powtórzeniach!

Populacje ludzkie różnią się między sobą częstością występowania poszczególnych alleli

sekwencji powtórzonych, np. w populacji ludzi rasy kaukaskiej (do tej populacji należą także

Polacy) najczęstszymi allelami sekwencji D1S80 są allele o 18 i 24 powtórzeniach.

Pamiętając o tym, że jesteśmy organizmami diploidalnymi, musimy sobie zdawać spra-

wę, że na obu naszych chromosomach pierwszej pary może znajdować się ten sam allel

sekwencji D1S80 (jesteśmy wtedy homozygotami względem D1S80) lub też różne allele

(wtedy mówimy o heterozygotyczności). Z badań nad częstością występowania alleli D1S80

wynika, że ponad 86% populacji ludzkiej jest heterozygotami w tym locus.

Jak bada się sekwencje powtórzone?

Najczęściej wykorzystywaną metodą badania polimorizmu sekwencji powtórzonych

różniących się długością jest rozdział elektroforetyczny produktów reakcji PCR w żelu

agarozowym lub poliakrylamidowym.

Co to jest PCR?

PCR (ang. P olymerase C hain R eaction), czyli łańcuchowa reakcja polimerazy jest jedną

z podstawowych technik biologii molekularnej. Wykorzystywana jest do namnażania kon-

kretnych fragmentów DNA. Jej podstawowym atutem jest szybkość oraz prostota.

W PCR wykorzystano podstawowe zasady replikacji DNA przez enzym zwany polimerazą

DNA. Enzym ten jest w stanie dołączyć nukleotyd tylko do wolnej grupy -OH na 3’końcu

nici, kierunek polimeryzacji jest wobec tego określony: 5’ -> 3’. Ponadto, polimeraza do

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: