KWASY NUKLEINOWE I STRUKTURA CHROMATYNY
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Wzory zasad purynowych i pirymidynowych występujących w RNA i DNA, nukleozydów i nukleotydów (powtórzenie wiadomości omawianych w trakcie kursu chemii bioorganicznej).
2. Struktura oligonukleotydów (rybo- i 2'-deoksyrybo-), zapis pełny i skrócony.
3. Struktura nukleosomu, histony i ich rola w stabilizacji struktury nukleosomu.
4. Podstawowe cechy struktury RNA i DNA.
5. Metody wykorzystywane do izolowania i analizy DNA.
6. Podstawowe różnice pomiędzy organizacją genomu pro- i eukariotycznego.
WPROWADZENIE
Podstawowe cechy struktury DNA i RNA
DNA jest nośnikiem informacji genetycznej zarówno u Procariota i Eucariota, a także niektórych wirusów.
Pojedynczy łańcuch DNA składa się z czterech deoksyrybonukleozydów, wielokrotnie powtarzających się w różnych sekwencjach (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP), połączonych wiązaniami 3’,5’ fosfodiestrowymi. Pierwszy deoksyrybonukleotyd łańcucha DNA posiada wolną resztę fosforanową w pozycji 5’; a ostatni ma wolną grupę 3’-hydroksylową deoksyrybozy. W rezultacie każdy łańcuch DNA wykazuje polarność budowy – koniec 5’ jest odmienny od końca 3’.
Watson i Crick w 1953 roku opublikowali trójwymiarowy model struktury DNA. Na podstawie badań rentgenograficznych przeprowadzonych przez Franklin i Wilkinsa ustalili, że DNA zbudowany jest z dwóch helikalnie splecionych nici. Dwa łańcuchy DNA są ułożone antyrównolegle względem siebie, jedna nić zorientowana jest w kierunku 5’®3’, a druga odwrotnie – 3’®5’. Zasady są skierowane do wnętrza helisy, a łańcuch cukrowo-fosforanowy znajduje się na zewnątrz. Pomiędzy zasadami znajdującymi się w przeciwległych łańcuchach tworzą się wiązania wodorowe. Adenina tworzy parę z tyminą łącząc się dwoma mostkami wodorowymi. Guanina łączy się z cytozyną za pomocą trzech mostków wodorowych. W centralnym obszarze helisy między parami zasad powstają oddziaływania typu asocjacji warstwowej.
Dwupasmowy DNA istnieje przynajmniej w sześciu formach (A-E i Z). W warunkach fizjologicznych występuje zwykle helikalna forma B, w której na pojedynczy skręt przypada około 10 par zasad (pz). Skok helisy wynosi 3,4 nm, a jej średnica 2 nm.
Cząsteczki DNA mogą osiągać znaczne rozmiary. Długość cząsteczki DNA wirusa polioma wynosi 1,7 μm (5100 pz), Escherichia coli – 1,36 mm (4,6 x 106 pz), w największym chromosomie Drosophila melanogaster - 2,1cm (6,2 x 107 pz). Sumaryczna długość genomu haploidalnego człowieka wynosi około 1 metra (3 x 109 pz). Najkrótsza cząsteczka chromosomowego DNA człowieka osiąga rozmiar 1,6 cm, a najdłuższa – około 8,4 cm.
Cząsteczki DNA ulegają w komórce niewielkim modyfikacjom. Ograniczają się one do metylacji grup aminowych adeniny i cytozyny.
Kwas rybonukleinowy jest polimerem rybonukleotydów. Cząsteczki RNA zawierają w różnych sekwencjach rybonukleotydy adeniny, guaniny, cytozyny i uracylu. W niektórych klasach RNA mogą występować inne zasady, które powstają na skutek modyfikacji potranskrypcyjnych. Rybonukleotydy połączone są wiązaniami fosfodiestrowymi analogicznie jak w DNA. RNA jest zazwyczaj pojedynczą cząsteczką. W obrębie nici często występują odcinki dwuniciowe. Tworzą je sekwencje zawierające komplementarne zasady ułożone w odwrotnej polarności. W związku z tym cząsteczki RNA posiadają zdolność przybierania skomplikowanych struktur. Dużym udziałem sparowanych fragmentów charakteryzują się cząsteczki rybosomowych RNA (rRNA) i transportujących RNA (tRNA), drugorzędową strukturę wykazują także eukariotyczne informacyjne RNA (mRNA). RNA ulega bardzo zróżnicowanym modyfikacjom po transkrypcji, co odzwierciedla różnorodność jego funkcji pełnionych w komórce.
W komórkach eukariotycznych występują w dużej ilości niewielkie cząsteczki RNA. Drobne jądrowe snRNA uczestniczą w procesie dojrzewania mRNA i regulacji ekspresji genów. Szereg niskocząsteczkowych RNA posiada aktywność katalityczną, są to rybozymy. RNA jest jednocześnie przenośnikiem informacji genetycznej i cząsteczką zdolną do katalizy. Powyższe fakty pozwoliły na postawienie hipotezy, że w ewolucji życia RNA pojawił się przed DNA i białkiem.
Zasadnicze cechy organizacji genomu eukariotycznego i prokariotycznego
W jądrze DNA jest upakowany w chromosomy. Każdy chromosom zawiera jedną długą, liniową, dwuniciową cząsteczkę DNA.
Chromosomowy DNA występuje w połączeniu z białkami, tworząc chromatynę. Wśród białek chromatyny wyróżniamy histony oraz liczną grupę białek, zwanych niehistonowymi. Białka niehistonowe pełnią rozliczne funkcje. Wśród nich wyróżniamy enzymy biorące udział w procesach zachodzących na terenie jądra, białka o charakterze regulatorowym jak np. receptory hormonów steroidowych, a także białka utrzymujące strukturę jądra.
Histony są typowymi białkami strukturalnymi, tworzącymi zrąb chromatyny. Są to niewielkie białka, a w ich składzie około 25% sekwencji stanowią zasadowe aminokwasy - lizyna i arginina. Właściwości histonów oraz ich klasyfikacja zależą od zawartości tych dwóch aminokwasów. Wyróżnia się histony bogate w lizynę (H1), umiarkowanie bogate w lizynę (H2A i H2B) i bogate w argininę (H3 i H4). Histony u różnych gatunków wykazują duże podobieństwo składu aminokwasowego, co przemawia za ich małą zmiennością ewolucyjną. W trakcie życia komórki ulegają licznym modyfikacjom potranslacyjnym, które zmieniają strukturę chromatyny, a zarazem jej funkcję.
Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom. Nukleosom jest to elipsoidalna cząstka zbudowana z histonów i opleciona nicią DNA. Trzon nukleosomu stanowi kompleks ośmiu cząsteczek histonów - (H2A, H2B, H3, H4) x 2. Na oktamer histonowy, nawinięty jest odcinek DNA w postaci lewoskrętnej superhelisy o długości około 146 pz. Odcinek ten tworzy 1,75 obrotu, a następnie przechodzi w tzw. DNA łącznikowy, łączący dwie sąsiednie podjednostki. Zazwyczaj długość DNA łącznikowego wynosi około 60 pz. Cały odcinek DNA przypadający na nukleosom stanowi około 200 pz. Siłami podtrzymującymi nić DNA na oktamerze białkowym są oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów zasadowych a ujemnie naładowanym ortofosforanem uczestniczącym w wiązaniach fosfodiestrowych łańcucha DNA. Długość DNA upakowanego w nukleosomach zmniejsza się około siedmiokrotnie. Strukturę chromatyny stabilizuje także histon H1 oraz białka niehistonowe. Histon H1 łączy się z odcinkami DNA poza rdzeniami nukleosomów. Dzięki tym oddziaływaniom, chromatyna może tworzyć struktury wyższego rzędu, jak np. solenoid. Tak utworzone włókno DNA jest przyłączone do centralnego rusztowania białkowego i tworzy serię pętli. Ogólny stopień skrócenia konturów DNA wynosi około 104. Podczas metafazy chromosomy występują w postaci najbardziej skondensowanej, a ich długość wynosi od 1,3 do 10 μm.
DNA komórek bakterii jest kolistą dwuniciową cząsteczką, często określaną jako chromosom bakteryjny. Znajduje się on w rejonie komórki zwanym nukleoidem. Kolisty genom jest zorganizowany w 50-100 superhelikalnie zwiniętych pętli lub domen, których końce połączone są z błoną komórkową za pośrednictwem kompleksu białkowego. Zwojom DNA towarzyszą białka podobne do histonów.
W wielu komórkach bakteryjnych występują plazmidy. Są to niewielkie, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA. Plazmidy posiadają zdolność autonomicznego namnażania się w komórkach bakteryjnych. DNA plazmidowy z reguły nie zawiera genów niezbędnych do życia bakterii. Wiele plazmidów posiada geny oporności na antybiotyki. Plazmidy są około 100 razy mniejsze od chromosomu bakteryjnego, ale posiadają podobny kolisty plan budowy i są superhelikalnie zwinięte.
Plazmidy stosowane w badaniach inżynierii genetycznej są sztucznie skonstruowanymi cząsteczkami DNA, pochodzącymi od naturalnego plazmidu E. coli. W biologii molekularnej często używanymi do analiz plazmidami jest pBR-322 o długości 4362 pz lub pUC 19 o długości 2686 pz. Znana jest ich sekwencja nukleotydowa, a także sekwencje rozpoznawane przez określone endonukleazy restrykcyjne.
Endonukleazy restrykcyjne bronią komórkę bakteryjną przed konsekwencją wnikania obcego DNA (np. wirusowego). Są to enzymy o bardzo dużej specyficzności działania i hydrolizują cząsteczki DNA w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwencji. Sekwencje te obejmują zazwyczaj cztery lub sześć ściśle określonych pz tworzących tzw. palindrom (Rys. 1).
Endonukleazy restrykcyjne z uwagi na bardzo wysoką specyficzność działania znalazły szerokie zastosowanie w badaniach genomów i w innych dziedzinach biologii molekularnej.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
1. Izolowanie DNA z grasicy cielęcej
Metody stosowane do wyodrębnienia DNA z materiału biologicznego mają na celu otrzymanie preparatu czystego pod względem chemicznym i jednocześnie o możliwie nieuszkodzonej strukturze.
Preparatom DNA towarzyszą zanieczyszczenia białkami jądrowymi i RNA. Metody służące do oczyszczania DNA kładą nacisk na usunięcie tych substancji. W postępowaniu preparatywnym należy ograniczać działanie deoksyrybonukleaz. W tkankach pobranych do preparatyki zostają zaburzone systemy regulacyjne i nukleazy atakują DNA komórkowy, powodując jego stopniową degradację. Właściwości tkanki, z której izoluje się DNA, mogą wpływać na stopień trudności preparatyki. Istotna jest aktywność enzymów nukleolitycznych znajdujących się w danej tkance, stosunek ilościowy RNA/DNA oraz zawartość DNA. Przykładowo, wysoką aktywnością nukleaz charakteryzują się śledziona i trzustka, stosunkowo niską zaś grasica. Zawartość DNA w różnych tkankach waha się w szerokim zakresie od około 0,2% w wątrobie szczura do 2,5% w grasicy cielęcej. Stosunek RNA/DNA wynosi około 4 dla wątroby szczura, dla grasicy cielęcej tylko 0,4. Te kryteria powodują, że grasica cielęca jest dogodnym materiałem do izolowania DNA.
Zasada metody
Izolowanie DNA obejmuje dwa etapy:
1. Uzyskanie z grasicy deoksyrybonukleoproteidu (DNP), możliwie wolnego od zanieczyszczeń rybonukleoproteidem (RNP).
Grasicę należy poddać homogenizacji w roztworze NaCl o stężeniu 0,15 mol/dm3 z dodatkiem cytrynianu sodu. Homogenizacja powoduje zniszcze...
kranium