BADANIE KINETYKI REAKCJI HYDROLIZY SACHAROZY KATALIZOWANEJ PRZEZ INWERTAZĘ Z DROŻDŻY.pdf

BADANIE KINETYKI REAKCJI HYDROLIZY SACHAROZY

KATALIZOWANEJ PRZEZ INWERTAZ Ħ Z DRO ņ D ņ Y

Cel ę wiczenia:

Celem ę wiczenia jest badanie kinetyki reakcji hydrolizy sacharozy

katalizowanej przez enzym – inwertaz ħ oraz wyznaczenie stałej Michaelisa dla

tej reakcji.

Podstawy teoretyczne:

Enzymy s Ģ białkami posiadaj Ģ cymi zdolno Ļę do niezwykle efektywnego

katalizowania reakcji organicznych. Przy Ļ pieszenie reakcji odbywa si ħ poprzez

obni Ň enie bariery aktywacji, które jest skutkiem tworzenia niskoenergetycznych

kompleksów enzymu z substratem (ES). Wi Ģ zanie substratu zachodzi w miejscu

zwanym miejscem aktywnym enzymu . Na skutek utworzenia si ħ kompleksu ES

tworzy si ħ konkurencyjna w stosunku do reakcji niekatalizowanej Ļ cie Ň ka

reakcyjna, w której energia stanu przej Ļ ciowego jest ni Ň sza ni Ň dla reakcji

zachodz Ģ cej przy braku enzymu. Jeden z najszybciej działaj Ģ cych enzymów,

anhydraza w ħ glanowa katalizuje reakcj ħ przeniesienia CO 2 z tkanek do krwi.

Enzym ten przy Ļ piesza reakcj ħ 10 7 razy w stosunku do reakcji niekatalizowanej.

Miar Ģ aktywno Ļ ci enzymów jest maksymalna liczba obrotów , która okre Ļ la

liczb ħ aktów reakcyjnych, w które wchodzi cz Ģ steczka enzymu na jednostk ħ

czasu w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratem. W tabeli nr 1

zestawiono przykładowe warto Ļ ci liczby obrotów.

Tabela 1.

ENZYM

LICZBA OBROTÓW

K M /

µ M

ANHYDRAZA W Ħ GLANOWA

600000

8000

PENICYLINAZA

2000

CHYMOTRYPSYNA

100

5000

POLIMERAZA DNA I

LIZOZYM

0,5

Dla wielu enzymów szybko Ļę katalizy zmienia si ħ ze st ħŇ eniem substratu. Przy

stałym st ħŇ eniu enzymu szybko Ļę zale Ň y prawie liniowo od st ħŇ enia substratu,

je Ļ li jest ono małe. Przy du Ň ych st ħŇ eniach substratu, szybko Ļę prawie nie

zale Ň y od st ħŇ enia (Rys 1). W roku 1913 L. Michaelis i M. Menten

zaproponowali model odpowiadaj Ģ cy przedstawionej charakterystyce

kinetycznej. Zakłada on, Ň e reakcja jest dwuetapowa: w pierwszym etapie

tworzy si ħ kompleks ES wyst ħ puj Ģ cy w równowadze z substratami E i S, w

drugim etapie kompleks ES jest rozkładany do produktu z odtworzeniem

cz Ģ steczki wolnego enzymu E:

k b

E + S

E + P

Rys. 1. Zale Ň no Ļę szybko Ļ ci reakcji enzymatycznej od st ħŇ enia substratu

V max

V max /2

K M

C substr

Odwołuj Ģ c si ħ do przybli Ň enia stanu stacjonarnego mo Ň na napisa ę wyra Ň enie

opisuj Ģ ce wypadkow Ģ szybko Ļę tworzenia ES:

sybko Ļę tworzenia ES = k a [E][S] – k a’ [ES] – k b [ES] = 0

st Ģ d:

[ES] =

[E][S]

Całkowite st ħŇ enie enzymu [E 0 ] jest sum Ģ st ħŇ e ı enzymu wolnego [E] i

zwi Ģ zanego [ES]. Poniewa Ň ilo Ļę wprowadzonego enzymu jest niewielka,

st ħŇ enie wolnego substratu [S] jest praktycznie równe jego st ħŇ eniu

całkowitemu a wi ħ c mo Ň na pomin Ģę ró Ň nic ħ mi ħ dzy [S] a [S] + [ES] st Ģ d:

[ES] =

[E] [S]

+ k a [S]

Przy zało Ň eniu, Ň e etap okre Ļ lony stał Ģ szybko Ļ ci k b jest najwolniejszy, szybko Ļę

reakcji wyra Ň ona jest równaniem:

V = k b [ES] = k[E 0 ]

gdzie:

k =

k [ S]

[ S] + K M

Stała K M zwana stał Ģ Michaelisa (patrz tab. 1) jest okre Ļ lona jako:

K =

k a

(Wykaza ę , Ň e je Ļ li k b << k a’ , jest ona równa stałej dysocjacji kompleksu [ES]).

Je Ļ li [S] >> K M to wtedy reakcja przebiega z szybko Ļ ci Ģ maksymaln Ģ , gdzie:

V MAX = k b [E 0 ]

a stała k b zwana jest maksymaln Ģ liczb Ģ obrotów.

Łatwo udowodni ę , Ň e szybko Ļę reakcji V przy dowolnym st ħŇ eniu substratu jest

powi Ģ zana z V MAX relacj Ģ :

[ S]

V =

[ S] + K

V MAX

Równanie powy Ň sze stanowi podstaw ħ analizy kinetyki reakcji enzymatycznych

metod Ģ wykresu Lineweavera-Burka. Po odwróceniu równania otrzymuje si ħ

zale Ň no Ļę :

1/V = 1/V max + (K M /V MAX )[S] -1

Po przedstawieniu powy Ň szej zale Ň no Ļ ci w układzie liniowym, mo Ň na

wyznaczy ę warto Ļ ci K M oraz k b .

Opis metody:

Roztwory zwi Ģ zków optycznie czynnych (jak np. sacharozy, glukozy,

fruktozy) posiadaj Ģ wła Ļ ciwo Ļę skr ħ cania płaszczyzny polaryzacji Ļ wiatła. K Ģ t

skr ħ cenia jest wprost proporcjonalny min. do st ħŇ enia substancji optycznie

czynnej. Zmiany st ħŇ e ı reagentów mo Ň na Ļ ledzi ę obserwuj Ģ c zmiany

skr ħ calno Ļ ci optycznej roztworów w czasie. Wykorzystuje si ħ przy tym to, Ň e

sacharoza jest optycznie prawoskr ħ tna, powstaj Ģ ca glukoza równie Ň , natomiast

fruktoza w silniejszym stopniu skr ħ ca płaszczyzn ħ polaryzacji Ļ wiatła w lewo.

Dlatego podczas reakcji obserwuje si ħ zmian ħ warto Ļ ci k Ģ ta skr ħ cenia w lewo.

W trakcie zaj ħę przeprowadza si ħ dwie serie pomiarowe przy ró Ň nych

st ħŇ eniach sacharozy. Szybko Ļę pocz Ģ tkow Ģ reakcji wyznacza si ħ z zale Ň no Ļ ci

k Ģ ta skr ħ cenia płaszczyzny polaryzacji w funkcji czasu. Stał Ģ Michaelisa

wyznacza si ħ graficznie z równania Lineweavera-Burka.

Aparatura i odczynniki:

2 cylindry 50 ml

3 pipety

stoper

roztwór sacharozy w buforze octanowym (pH=4,8)

roztwór inwertazy w wodzie

polarymetr półcieniowy

Wykonanie pomiarów:

1. Ustawi ę termostat na 25 0 C

2. Odwa Ň y ę na wadze analitycznej 13,6600 – 13,7000 g sacharozy i

rozpu Ļ ci ę j Ģ w buforze octanowym tak aby otrzyma ę 100 ml roztworu

(kolba miarowa 100 ml).

3. Do cylindra z korkiem pobra ę pipet Ģ 20 ml roztworu sacharozy w buforze

octanowym.

4. Do drugiego cylindra pobra ę pipet Ģ 20 ml roztworu enzymu.

5. Wł Ģ czy ę transformator do sieci i zapali ę lamp ħ sodow Ģ .

6. Umie Ļ ci ę oba cylindry w termostacie na 10 –15 minut.

7. Nastawi ę okular polarymetru na najwy Ň sz Ģ ostro Ļę i wprawi ę si ħ w

nastawianiu analizatora na jednakowe zaciemnienie obu pól (patrz

instrukcja przyrz Ģ du).

8. Wyj Ģę oba cylindry z termostatu.

9. Wla ę roztwór enzymu do roztworu sacharozy wł Ģ czaj Ģ c jednocze Ļ nie

stoper (stoper powinien zosta ę wł Ģ czony w momencie wlania pierwszej

kropli enzymu).

10.Zamkn Ģę cylinder korkiem i wymiesza ę zawarto Ļę ( nie wytrz Ģ sa ę ! ).

11.Otrzymany roztwór wla ę do rurki polarymetrycznej z płaszczem grzejnym

tak, aby utworzyła si ħ wypukła powierzchnia cieczy, a nast ħ pnie

szkiełkiem Ļ ci Ģę menisk tak, aby nie było p ħ cherzyków powietrza.

12.Umie Ļ ci ę rurk ħ w polarymetrze i po 1 minucie od zmieszania roztworów

ustawi ę analizator na jednakowe zaciemnienie obu pól a nast ħ pnie

odczyta ę warto Ļę k Ģ ta skr ħ cenia płaszczyzny polaryzacji Ļ wiatła z

dokładno Ļ ci Ģ do 0,05 0 . Wykona ę 7 pomiarów k Ģ ta skr ħ cenia co 2 min.

Nastawianie analizatora rozpocz Ģę pół minuty wcze Ļ niej. Musi by ę ono

wykonane w okre Ļ lonym czasie (sam odczyt mo Ň na zrobi ę nieco pó Ņ niej).

13. W mi ħ dzyczasie umy ę dokładnie cylindry wod Ģ i w jednym z nich

umie Ļ ci ę ponownie 20 ml roztworu enzymu a w drugim 15 ml roztworu

sacharozy w buforze octanowym oraz 5 ml buforu.

14. Umie Ļ ci ę oba cylindry w termostacie na 10 –15 minut.

15.Wykona ę ponownie czynno Ļ ci jak w pkt. 8-12.

16.Nast ħ pnie wykona ę analogicznie kolejne 2 serie pomiarów stosuj Ģ c

odpowiednio 10 ml roztworu sacharozy w buforze octanowym oraz 10 ml

buforu i 5 ml roztworu sacharozy w buforze i 15 ml buforu

17. Zmierzy ę skr ħ calno Ļę wyj Ļ ciowego roztworu sacharozy.

18.Po zako ı czeniu pomiarów wył Ģ czy ę termostat i lamp ħ sodow Ģ oraz umy ę

dokładnie wod Ģ naczynia i rurk ħ .

Opracowanie wyników:

1. Sporz Ģ dzi ę wykresy zale Ň no Ļ ci k Ģ ta skr ħ cenia płaszczyzny polaryzacji

Ļ wiatła w funkcji czasu i wyznaczy ę z nich szybko Ļę pocz Ģ tkow Ģ

reakcji (skorzysta ę z zał Ģ czonej krzywej wzorcowej zale Ň no Ļ ci k Ģ ta

skr ħ cenia płaszczyzny polaryzacji Ļ wiatła mieszaniny reakcyjnej w

funkcji st ħŇ enia sacharozy).

2. Sporz Ģ dzi ę wykres 1/V = f(1/S) i w oparciu o niego wyznaczy ę

warto Ļę stałej Michaelisa K M .

3. Sformułowa ę wnioski.

LITERATURA:

1. P. W. Atkins – Chemia Fizyczna- PWN

2. L. Stryer – Biochemia - PWN

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: