Endotoksyny.doc

6.5.2. Owadobójcze delta-endotoksyny

Na przestrzeni ostatniego półwiecza zużycie chemicznych środków owadobójczych podwaja się co 10 lat. Stosuje się je do zwalczania szkodników upraw oraz owadów roznoszących rozmaite choroby. Jednakże poważną wadą tych substancji jest ich mała specyficzność w stosunku do żywych organizmów. Stąd, mogą powodować liczne zatrucia ludzi i zwierząt. Ponadto likwidują nie tylko szkodniki, ale również pożyteczne owady, w tym naturalnych wrogów danego szkodnika. Wiele z tych związków jest trudno biodegradowalnych i ich stężenie w wielu regionach niepokojąco rośnie, powodując zachwianie równowagi w naturalnych ekosystemach.

Od 25 lat alternatywą dla stosowania owadobójczych substancji chemicznych stały się biopestycydy. Najlepiej poznanym i szeroko stosowanym biopestycydem są białka δ-endotoksyn otrzymywane z hodowli różnych odmian bakterii Bacillus thuringiensis (Bt). Ta pospolita bakteria glebowa najczęściej spotykana jest w pyle zbożowym zalegającym silosy i inne pomieszczenia służące do przechowywania zboża. Ustalono, że istnieją tysiące odmian B.thuringiensis. Każda odmiana w trakcie sporulacji produkuje własne unikalne kryształy insektycydowego białka, które są odkładane w komórkach poza przetrwalnikiem. Insektycydowa aktywność toksyn z każdej odmiany Bt różni się. Dlatego też, zespół Bt delta-endotokyn atakuje rozmaite gatunki z rzędów chrząszczy (Coleoptera), ciem i motyli (Lepidoptera) czy much i moskitów (Diptera). Niektóre Bt delta-toksyny wykazują skuteczność toksycznego działanie na równi z syntetycznymi pestycydami (np. organofosforowymi). W odróżnieniu od organofosforowych pestycydów, które wykazują działania ogólne, Bt toksyny są bardzo wąsko specyficzne; wykazują skuteczność jedynie w stosunku do pewnych szkodliwych insektów i tym samym są bezpieczne dla większości nieszkodliwych, a nawet pożytecznych insektów i innych zwierząt. Ponadto Bt toksyny są biodegradowalne i nie zaśmiecają środowiska.

Poznano 34 podgatunki B.thuringiensis. Najbardziej wśród nich rozpowszechnione to: podgatunek kurstaki (przeciw Lepidoptera), israelensis (przeciw Diptera, głównie moskitom i czarnym muchom) i podgatunek tenebrionis (przeciw Leptinotarsa decemlineata, czyli stonce ziemniaczanej). Dwie główne grupy insektycydowych białkowych kryształów produkowanych przez odmiany tych bakterii zostały zidentyfikowane jako: Cyt (cytolizyny) i Cry (kryształy delta-endoksyn). W roku 1989 zdefiniowano cztery klasy genów Cry i dwie klasy genów Cyt. Toksyny CryI i CryII są aktywne przeciw ćmom i motylom, CryII i CryIV są przeciw muchom i moskitom a toksyna CryIII przeciw chrząszczom. Toksyny Cyt są aktywne w stosunku do much, moskitów oraz chrząszczy i ponadto przeciwko prawdziwym robakom (hemipterans) oraz karaluchom i termitom (dictyopterans). Toksyny CryIII są produkowane przez podgatunki B.thuringiensis zwane tenebrionis i tolworthi a CryIV przez israelensis. Ogólnie, nie znaleziono dotychczas jakiejś wyraźnej korelacji pomiędzy rodzajem toksyny a produkującym ją podgatunkiem bakterii. Toksyny Cry wiążą się ze specyficznymi receptorami komórkowymi środkowego fragmentu przewodu pokarmowego insektów. Toksyny Cyt, w odróżnieniu od toksyn Cry, nie rozpoznają specyficznych miejsc wiązania.

Delta-endotoksyny dzieli się ze względu na specyficzność w stosunku do poszczególnych rzędów owadów na cztery klasy: od CryI do CryIV; a te dalej - na podklasy i odmiany. Przykładowo białko d‑endotoksyny CryIA(c) jest toksyczne względem wielu owadów z rzędu Lepidoptera, ale tylko dla trzech gatunków z rodziny Torticidae (zwójki). Ta ukierunkowana specyficzność d‑endotoksyn ma najprawdopodobniej związek z ich wiązaniem się z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórek nabłonka jelita danego owada. Brak receptorów rozpoznających określone toksyny decyduje o niewrażliwości owadów.

Bacillus thuringiensis bezpośrednio powoduje śmiertelność insektów. Podobny skutek wywołują toksyny z rozmaitych odmian tych bakterii w następstwie podobnego sposobu działania. Po połknięciu przez insekta, kryształy delta-endotoksyn rozpuszczają się w jego środkowym fragmencie przewodu pokarmowego, uwalniając prototoksynę, z której są zbudowane. Ta dalej proteolitycznie przetwarzana jest do fragmentów, które wiążą się z błonami pokrywającymi wnętrze przewodu pokarmowego. Aktywne białka zakłócają osmolityczną równowagę tych komórek przez tworzenie por w membranach komórkowych prowadząc do lizy komórek. Jelito staje się sparaliżowane i insekt przestaje spożywać pokarm i większość z nich ginie w przeciągu kilku godzin. Toksyczność wspomnianych fragmentów toksyn w stosunku do danego insekta zależy od powinowactwa wiązania się z membranami komórkowymi.

B. thuringiensis po raz pierwszy na skalę przemysłową został zastosowany we Francji w 1938 roku. W Stanach Zjednoczonych jego handlowe znaczenie datuje się od 1950 roku. Od wiele lat, w formie aerozolu stosowany jest powszechnie przy uprawach roślin oraz do zwalczania owadów w leśnictwie. W latach 80-tych komercyjne zainteresowanie preparatami Bt bardzo szybko wzrosło, gdy okazało się, że wiele popularnych syntetycznych insektycydów staje się nieefektywnych z powodu wytworzenia się oporności insektów czy też nie nadaje się do użycia z powodu środowiskowych ograniczeń. Ponadto w tym samym czasie następuje rozwój inżynierii genetycznej. W 1987 roku pojawia się pierwszy raport o wbudowaniu genu kodującego biosyntezę delta-toksyn Bt do roślin. Pierwszymi (1993) transgenicznymi roślinami z ekspresją Bt toksyn były tytoń i pomidory. Dzisiaj, znaczące Bt transgeniczne uprawy obejmują kukurydzę, bawełnę, ziemniaki i ryż.

Równocześnie prowadzone są badania nad wyeliminowaniem kilku niekorzystnych cech dotychczas stosowanych preparatów. Chodzi tu głównie o zwiększenie ich trwałości, a także o wyeliminowanie z nich spor i niektórych metabolitów wtórnych (m.in. b‑egzotoksyny i hemolizyny, które mogą być toksyczne dla wielu organizmów). Badania te polegają na wprowadzaniu genów kodujących d-endotoksyny Bacillus thuringiensis do innych komórek bakteryjnych (m.in. Pseudomonas fluorescens, Bacillus megaterium czy Bacillus sphaericus, który również produkuje swoiste toksyny (w stosunku do owadów z rzędu Diptera) lub na ich wprowadzaniu do roślin.

Również niektóre inne gatunki Bacillus (wspomniany już Bacillus sphaericus, Bacillus cereus, Bacillus popilliae, Bacillus larvae i Bacillus lentimorbis) wytwarzają toksyny o białkowej naturze, aktywne w zwalczaniu owadów.

6..5.3. Antybiotyki

Początek ery antybiotyków datuje się na rok 1929r., gdy A. Fleming zaobserwował hamujący wpływ grzyba Penicillium notatum na wzrost bakterii Staphylococcus. W 1942r. wyizolowana została z Penicillium notatum penicylina, a z bakterii Bacillus brevis tyrotrycyna. W następnych latach odkryto wiele innych antybiotyków. Obecnie w lecznictwie stosuje się ich około 100. Niektóre z nich wytwarzane są w oparciu o wgłębną hodowlę bakterii Bacillus. Jako przykład można wymienić gramicydynę S, pierścieniowy dziesięciopeptyd wytwarzany przez Bacillus brevis. Gramicydynę S stosuje się jako składnik maści i roztworów używanych zewnętrznie do leczenia owrzodzeń oraz zainfekowanych ran i oparzeń.

Bakterie Bacillus brevis wytwarzają jeszcze inne antybiotyki, m.in. tyrocydyny A, B i C (główne składniki tyrotrycyny), będące również cyklicznymi oligopeptydami, zawierającymi a-D-fenyloalaninę, podobnie jak gramicydyna S. Znanych jest obecnie ponad 25 antybiotyków wytwarzanych przez różne szczepy tych bakterii.

Innym przykładem antybiotyku o budowie peptydowej jest bacytracyna, wytwarzana na skalę przemysłową (m.in. w PZF „POLFA” w Pabianicach) w oparciu o hodowlę bakterii Bacillus subtilis.

Bacytracyna jest mieszaniną spokrewnionych ze sobą cyklicznych peptydów wytwarzanych przez bakterie Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis. Mieszanina ta zawiera co najmniej 10 komponentów, z których tylko najbardziej znaczący, bacytracyna A, i jej utleniony odpowiednik, bacytracyna F, mają w pełni zdefiniowaną strukturę chemiczną.

Bacytracyna F powstaje z bacytracyny A: na drodze oksydatywnej zostaje usunięta grupa aminowa a tiazolowy pierścień ulega odwodornieniu. Wiadomo również, że bacytracyna B posiada trzy zmienione miejsca w stosunku do bacytracyny A (między innymi izoleucyna została zastąpiona waliną).

Bacytracyna w postaci soli cynkowej, a także w kombinacji z innymi antybiotykami (przeważnie polimyksyną B i neomycyną) jest używana w maściach (np. o nazwie handlowej „Neosporin” USA) w leczeniu infekcji skóry i oczu, a także zapobiegawczo przeciw infekcjom ran. Skuteczna jest przeciwko bakteriom Gram-dodatnim (gronkowce, paciorkowce), pałeczkom beztlenowców i niektórym pierwotniakom. Jest inhibitorem fosfatazy lipidowej. Używana bywa także, jako dodatek do paszy dla drobiu, świń, bydła i zwierząt futerkowych (z wyłączeniem królików).

Poszczególne szczepy bakterii Bacillus subtilis, obok bacytracyny, produkują ponad 65 innych antybiotyków o budowie polipeptydowej. Jednym z lepiej poznanych jest subtilina (podobna do bacytracyny), antybiotyk o wysokiej aktywności w stosunku do bakterii gram-dodatnich i rozmaitych patogennych grzybów. Należy do grupy lantibiotyków, czyli antybiotyków peptydowych zawierających lantioninę - bis(2-amino-2-karboksyetylo)siarczek - o wzorze chemicznym HOOC-CH(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)-COOH.

Z kolei Bacillus polymyxa wytwarza polimiksyny. Z punktu widzenia budowy chemicznej przypominają one peptydy. DAB jest kwasem α,γ-diaminomasłowym, połączony z innymi aminokwasami wiązaniami peptydowymi. Stąd antybiotyki te zalicza się do polipeptydowych.

Polimiksyny należą do antybiotyków o wąskim zakresie działania, działają jedynie na bakterie Gram-ujemne. Jednakże charakteryzują się silnymi właściwościami bakteriobójczymi.

Tabela 6.1. Antybiotyki produkowane przez bakterie z rodzaju Bacillus

Antybiotyki bakterii z rodzaju Bacillus wykazują pełny przedział antymikrobiologicznej aktywności: bacytracyna, pumulina, laterosporyna, gramicydyna i tyrocydyny są efektywne przeciw Gram-dodatnim bakteriom; kolistyna i polimiksyna są anty-Gram-ujemne; difficydyna posiada szerokie spektrum działania; a mykobacilina i zwittermycyna są przeciw grzybom. Ich działanie jest różne. Niektóre blokują syntezę ściany komórkowej lub zakłócają funkcje błon biologicznych, inne, mniej liczne, zakłócają replikację, transkrypcję lub translację.

Wyjątkowy wśród bakterii z tego rodzaju jest Bacillus circulans, który syntetyzuje butyrozynę - antybiotyk aminoglukozydowy. Na drodze biotransformacji otrzymuje się obecnie z niego jeden z najefektywniejszych mutasyntetycznych antybiotyków, jakim jest amikacyna.

6..5.4. Nukleotydy purynowe

Nukleozydy i nukleotydy purynowe znalazły zastosowanie w medycynie i jako środki poprawiające smak. Nukleotydy: kwas guanylowy (guanozyno-5’-fosforan - GMP), kwas inozynowy i kwas ksantynowy są produkowane głównie w oparciu o hodowle Corynebacterium glutamicum, ale alternatywną drogą jest użycie Bacillus subtilis syntetyzującego nukleozydy i ich późniejsza chemiczna fosforylacja.

Biosynteza rybonukleotydów purynowych u Bacillus subtilis podlega złożonej inhibicji na zasadzie sprzężenia zwrotnego i represji końcowym produktem. Jedynie mutanty odporne na efekt sprzężenia zwrotnego są wykorzystywane do celów produkcyjnych. Do przemysłowej produkcji inozyny używa się mutantów Bacillus subtilis K, u których nukleozyd łatwo przechodzi przez membrany komórkowe do podłoża hodowlanego. Wydajność większą niż 20g/dm3 uzyskuje się z zastosowaniem adenino-auksotrofowych mutantów.

Z kolei u guanozyno-produkcyjnych szczepów Bacillus subtilis, brakuje reduktazy GMP (EC 1.7.1.7). Mutanty te wywodzą się z producentów inozyny. Wydajność guanozyny w tym procesie jest nie mniejsza niż 8g/dm3.

Mutanty Bacillus subtilis stosowane do produkcji ksantyny są guanino-auksotrofami. Wydajność biosyntezy tego nukleozydu sięga nawet 15g/dm3.

6.5.4. Witaminy

W chwili obecnej jedynie niewielka ilość witamin produkowana jest komercyjnie przez hodowlę drobnoustrojów. Jednakże postęp w klonowaniu genów strukturalnych ryboflawiny, kobalaminy i biotyny w genomie bakterii Bacillus, w kombinacji z wykorzystaniem genetycznej i metabolicznej strategii rekonstrukcji, zapewnia potencjał skłaniający do wykorzystania szczepów Bacillus w produkcji witamin na skalę przemysłowa. Ponadto stwierdzono, że mutacja w operatorze ribO ryboflawinowego operonu, prowadzi do kilkakrotnej nadprodukcji ryboflawiny.

Do tradycyjnie używanych przemysłowych producentów witamin zalicza się wyższe grzyby (Ascomycetes), Eremothecium ashbyii i Ashbya gossypii. Jednakże, bakterie i drożdże mają przewagę nad nimi z uwagi na możliwość obwitego wzrostu i użycia prostych syntetycznych podłoży. Aktualnie rozważa się wykorzystanie trzech różnych mikroorganizmów do produkcji ryboflawiny: nitkowatego grzyba Ashbya gossypii; drożdży Candida famata i Bacillus subtilis. Dwa pierwsze mikroorganizmy w piątym dniu hodowli wytwarzają maksymalne ilości ryboflawiny na poziomie 20g/dm3. Corynebacterium ammoniagenes również nagromadza w podłożu ryboflawinę na poziomie 20g/dm3, ale w krótszym trzydniowym cyklu.

Bacillus subtilis, w optymalnych warunkach, zapewnia wydajność produkcji ryboflawiny na poziomie 30g/dm3 w ciągu trzech dni hodowli. W związku z tym, staje się najbardziej atrakcyjnym mikrobiologicznym producentem ryboflawiny.

6.5.5. Kwas poliglutaminowy

Kwas poliglutaminowy (PGA) jest anionowym naturalnym homopoliamidem, który jest zbudowany z jednostek kwasu D- i ...