ĆWICZENIE 5

BIOLOGICZNE PROCESY ROZKŁADU MATERII ORGANICZNEJ.

Literatura zalecana:

1.       Schlegel G. Hans: Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000, str. 500-535.

2.       Duvigneand Paul: Biosfera jako środowisko człowieka, str. 91-96

Zagadnienia szczegółowe:

-          Znajomość pojęć: biodegradacja, biokumulacja, enzymy adaptacyjne, kometabolizm, ksenobiotyk.

-          Rozkład substancji naturalnych: celuloza, ksylan, skrobia, pektyny, chityna, lignina, węglowodory, białka.

-          Rozkład syntetycznych związków organicznych: chlorowcowane fenole, detergenty.

-          Mikrobiologiczne przemiany metali ciężkich.

-          Czynniki wpływające na podatność substancji organicznych na rozkład biologiczny.

Zadanie 1.

Rozkład fenolu przez drobnoustroje wyizolowane z wody powierzchniowej oraz przez szczep bakterii Psedomonas fluorescens.

Materiały:              

Zawiesina drobnoustrojów wyizolowanych z wody powierzchniowej oraz szczepu bakterii Psedomonas fluorescens, kolby płaskodenne z podłożem minimalnym 80 cm3, 0,1% roztwór fenolu, kolbki miarowe o pojemności 50 cm3, bufor fosforanowy, roztwór 4-aminoantypiryny, roztwór żelazicyjanku potasowego.

Wykonanie:

Do kolby płaskodennej o objętości 250 cm3 zawierającej 80 cm3 sterylnego podłoża minimalnego dodać sterylnie 10 cm3 0,1% roztworu fenolu i zaszczepić drobnoustrojami wyizolowanymi z wody powierzchniowej oraz bakteriami  Psedomonas fluorescens. Jednocześnie przygotować zestaw kontrolny zawierający sterylne podłoże minimalne i fenol w takiej ilości jak w próbie zaszczepionej

bakteriami. Kolby ustawić na wytrząsarce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 72 h. Po tym czasie pobrać 10 cm3 hodowli, odwirować przez 10 minut z prędkością 10 tys. obr./min i oznaczyć zawartość fenolu w 1cm3 supernatantu. Jednocześnie oznaczyć zawartość fenolu w próbce kontrolnej.

Oznaczanie fenolu – metoda 4-aminoantypirynowa:

              Fenole lotne z parą wodną reagują przy pH=4 w obecności żelazicyjanku potasowego z 4-aminoantypiryną tworząc pochodne indofenolowe o zabarwieniu od żółtego do czerwonego, w zależności od stężenia fenolu.

Do kolbki miarowej o poj. 50 cm3 wprowadzić 1 ml badanej próby, dodać 20 ml buforu fosforanowego (pH=7,9), dobrze wymieszać. Następnie dodać 0,5 ml r-ru 4-aminoantypiryny, dobrze wymieszać. Dodać 0,5 ml r-ru żelazicyjanku potasowego, dobrze wymieszać. Po 15 minutach odczytać absorpcję przy długości fali 500 nm względem próby kontrolnej. Określić stężenie fenoli w próbce z krzywej wzorcowej.

Sporządzenie krzywej wzorcowej.

Do kolejnych czterech kolbek miarowych o poj. 50 ml wprowadzić 1, 2, 5, 10 ml roztworu fenolu zawierającego w 1ml 0,01 mg fenolu (100-krotnie rozcieńczony 0,1% r-r fenolu). Dalej postępować jak podano wyżej przy oznaczaniu fenoli w badanej próbce. Odczytać absorpcję kolejnych wzorców i sporządzić krzywą wzorcową.

Zadanie 2.

Obserwacja rozkładu celulozy przez organizmy glebowe i osadu dennego

Materiały:

Różne rodzaje gleb, gleba wyjałowiona termicznie, krążki bibuły, pojemniki na glebę, duże szkiełka zegarkowe.

Wykonanie:

1.       Napełnić pojemniki do połowy badaną glebą;

2.       Położyć na powierzchnię podłoża krążek bibuły (celuloza) i zwilżyć go wodą;

3.       Przykryć szkiełkiem zegarkowym;

4.       Analogicznie nastawić próbę kontrolną z podłożem wyjałowionym w wysokiej temperaturze.

Obserwować powierzchnię krążków przez okres paru tygodni. Zwrócić uwagę na pojawiające się plamy o różnym zabarwieniu i powstające w ich miejscu ubytki.

Porównać intensywność rozkładu celulozy na różnych podłożach i w próbach kontrolnych.

Zadanie 3.

Obserwacja rozkładu wybranych materiałów tekstylnych w środowisku glebowym.

Materiały:

Różne rodzaje gleb, gleba wyjałowiona termicznie, próbki tkanin, pojemniki na glebę.

Wykonanie:

1.       Wprowadzić do każdej z gleb badany materiał i przetrzymać przez kilka tygodni;

2.       Utrzymać wilgotność prób przez skrapianie wodą;

3.       Po kilku tygodniach obserwować zmiany na powierzchni tkanin i porównać wyniki.

Zadanie 4.

Rozkład drewna i celulozy przez grzyby pasożytujące na drzewach.

Materiały:

Zawiesina grzybni korowicy (Phanerochete sp.), pożywka mineralna o pH=4,5, krążki bibułowe, kawałki drewna, kolby stożkowe.

Wykonanie:

Rozkład drewna

1.       Wprowadzić sterylnie do kolbek z pożywką zawierającą drewno ok. 0,5 ml zawiesiny grzybni;

2.       Przygotować próbę kontrolną przez wprowadzenie 0,5 ml zawiesiny do pożywki nie zawierającej drewna;

3.       Inkubować w temp. 37oC;

4.       Obserwować wzrost grzyba w obu próbach.

Zmiany w drewnie powodowane przez grzyb mogą być widoczne gołym okiem dopiero po dłuższym czasie biodegradacji, ze względu na obecność w drewnie trudno rozkładalnych substancji ligninowych (osłaniających celulozę). Dlatego o dokonującym się procesie rozkładu można tu wnioskować pośrednio, np. na podstawie wzrostu grzybni. Porastanie przez grzyb drewna świadczy o procesie jego rozkładu, gdyż w pożywce nie ma innych źródeł węgla. Ewentualny ograniczony wzrost w próbie kontrolnej, może wynikać z wprowadzenia niewielkich ilości związków organicznych wraz z inokulum.

Rozkład celulozy

1.       Wprowadzić sterylnie do kolbek z pożywką mineralną krążek celulozowy;

2.       Zaszczepić pożywkę inokulum w postaci 0,5 ml zawiesiny grzybni;

3.       Przygotować próbę kontrolna (bez grzyba);

4.       Inkubować w temp. 37oC;

5.       Obserwować przez ok. 3 tygodnie zmiany zachodzące w krążkach badanych i kontrolnych. Wykonać preparaty mikroskopowe z obu krążków. Zwrócić uwagę na przerośnięcie włókien celulozowych strzępkami grzybni.