Wojciech Ślęczek
168560
SPRAWOZDANIE
Aktywność enzymatyczna
Doświadczenie 1
Wstęp teoretyczny:
Bufory - roztwory, których wartość pH po dodaniu niewielkich ilości mocnych kwasów albo zasad, jak i po rozcieńczeniu wodą prawie się nie zmienia. Roztwór buforowy to mieszanina kwasu i zasady czyli mieszanina protonodawcy i protonobiorcy według teorii Brönsteda.
Materiały:
- wyciąg (enzym) z ziemniaków
- 0,1M bufor fosforanowy (pH=7,4)
- 0,3% roztwór pirokatechiny
- woda destylowana
Opis: Do 4 kolejnych probówek dodano wyciąg z ziemniaka, wodę, bufor fosforanowy i pirokatechinę w proporcjach określonych przez poniższą tabelę:
Nr probówki
Wyciąg z
ziemniaka (ml)
Woda (ml)
Bufor
fosforanowy (ml)
Pirokatechina
(ml)
1
3
0
0,5
2
4
Probówkę nr 3 ogrzano we wrzącej łaźni wodnej i schłodzono do temperatury pokojowej, następnie dodano resztę odczynników. Zawartość wszystkich prób została dokładnie zmieszana i zostawiona na 30min, probówki 1-3 były regularnie wstrząsane co kilka minut.
Obserwacje: Roztwór w probówkach 1 i 4 zmienił barwę na brunatną, ciemno brązową. Barwa roztworów w probówkach 2 i 3 nie uległa zmianie.
Wnioski: Substratem reakcji jest pirokatechina i tlen. Reakcja utleniania pirokatechiny jest katalizowana przez enzymy zawarte w wyciągu z ziemniaka. Produktami tej reakcji są chinony dające brunatne zabarwienie w roztworze; próba nr 1 dała wynik pozytywny zmieniając kolor. W probówce nr 4 zabarwienie było lekko mniej brązowe, ze względu na bardziej ograniczony dostęp tlenu. W probówce nr 3 mimo nieobecności inhibitora, reakcja nie zaszła, ponieważ enzym został zdenaturowany pod wpływem wrzącej wody z łaźni. Próba nr 2 (brak substratu) i 3 to próby kontrolne.
Doświadczenie 2 - Próba benzydynowa
Peroksydaza jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach. Jej działanie związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, lecz wykorzystywany przez enzym w reakcjach utleniania substratów (np. fenoli).
Próba benzydynowa polega na wykryciu peroksydaz. W obecności peroksydazy benzydyna ulega utlenieniu przez nadtlenek wodoru do difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką zredukowanej benzydyny tworzy błękit benzydynowy.
- wyciąg z ziemniak
- odczynnik benzydynowy
Opis: Do dwóch przygotowanych probówek nalewamy po 1 ml wyciągu z ziemniaka, a następnie jedną z nich wkładamy do wrzącej łaźni wodnej i oziębiamy do temperatury pokojowej. Do obu probówek dodajemy po kilka kropli świeżo otrzymanego odczynnika benzydynowego i obserwujemy zmiany.
Obserwacje: W probówce 1 (nieogrzewana) roztwór zabarwił się na kolor granatowy, natomiast probówka 2 nie zmieniła zabarwienia.
Wnioski: Niebieskie zabarwienie probówki 1 oznacza obecność peroksydaz (wynik pozytywny). Jego brak w probówce 2 oznacza zdenaturowanie enzymu podczas ogrzewania w łaźni wodnej (próba negatywna).
Doświadczenie 3 - b-amylaza z nasion zbożowych
b-amylaza jest jedną z trzech rodzajów amylaz. Jest to enzym hydrolityczny z grupy hydrolaz, rozkładający skrobię i inne wielocukry. Występuje w soku trzustkowym i w ślinie (produkowana przez ślinianki). Zapoczątkowuje proces trawienia skrobi. Amylaza jest także syntezowana w owocach wielu roślin podczas dojrzewania powodując, że stają się one słodsze, a także podczas kiełkowania ziaren zbóż.
- wyciąg z nasion
- płyn Lugola
- odczynnik Benedicta
- 0,5% roztwór skrobi
Wykonanie: Przygotowujemy 6 probówek według tabelki:
Probówka
Czas inkubacji (min)
Czynności
30
Dodać 0,3ml zagotowanego i schłodzonego wyciągu z nasion
dodać 0,3ml wyciągu z nasion; wstawić do wrzącej łaźni wodnej
5
dodać 0,3ml wyciągu z nasion
10
20
6
Wszystkie probówki (oprócz 2giej) wstawić do łaźni wodnej o temp. 37oC na czas podany w tabeli. Następnie wstawić je do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut i oziębić. Zawartość każdej probówki rozdzielić na pół – w jednej probówce wykonać próbę Lugola, w drugiej natomiast próbę Benedicta.
Obserwacje:
Probówki
Próba Benedicta
r-r ciemnogranatowy
Reakcja nie zachodzi
biotech_pwr