Ćwiczenie VI.doc

Ćwiczenie VI                     29. 10. 2001

Temat: Metody hodowli i identyfikacji bakterii tlenowych i mikroaerofilnych.

Zapotrzebowanie na tlen:

-          bakterie bezwzględnie beztlenowe (tlen działa na nie zabójczo) – w składzie enzymów oksydacyjnych zawierają tylko dehydrogenazę

-          bakterie względnie tlenowe (rosną zarówno w warunkach tlenowych jak i w beztlenowych) – w składzie enzymów zawierają dehydrogenazy, katalazy, oksydazy cytochromowe (ale tylko niektóre)

-          bakterie bezwzględnie tlenowe (rosną tylko w obecności tlenu) – w składzie enzymów zawierają dehydrogenazy, katalazy, oksydazy, peroksydazy

-          bakterie mikroaeofilne (do wzrostu potrzebują mniejszej ilości tlenu niż w powietrzu atmosferycznym, stęż. O2 do 5 %), nie rosną na podłożach stałych w atmosferze tlenowej, w warunkach beztlenowych wzrastają słabo albo wcale np. Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni; optymalny wzrost tych bakterii odbywa się w atmosferze stanowiącej mieszaninę gazów: 5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2 (hodowla w generatorach)

Niektóre bakterie potrzebują zwiększonego stężenia CO2 od 5 – 15 %. Stosuje się generatory do hodowli lub cieplarki z przepływem CO2. Najprostszy sposób ich wyhodowania to umieszczenie płytki z hodowlą w eksykatorze, zapalenie świeczki i zamknięcie eksykatora np. Neisseria (czynnik etiologiczny rzeżączki), Haemophilus influenze (bakterie kapnofilne).

Hodowla bakterii beztlenowych:

a)      metody fizyczne

b)     metody fizykochemiczne

c)      metody chemiczne

d)     metody biologiczne.

Metody fizyczne – hodowla w wysokich słupkach agarowych. Przed posiewem, ogrzaniem podłoża do temperatury 55 stopni C ulega ono upłynnieniu. Schładzamy do temperatury 46 – 48 stopni C i wprowadzamy materiał za pomocą ezy lub pipetą lub też za pomocą wymazówki na samo dno podłoża. Zalewamy podłoże parafiną. Zestalamy przez dalsze ochłodzenie

.

   Zagotowanie pożywki (10 – 20 min.), szybko schładzamy pod strumieniem bieżącej zimnej   wody. Posiewamy materiał i przykrywamy warstwą jałowej parafiny.

Hodowla w aerostatach – metalowe naczynia z dwoma bocznymi kranami i manometrem. Przez jeden kranik wypompowuje się zawarte w eksykatorze powietrze, poprzez drugi na to miejsce wprowadzany jest gaz – mieszanina N, H i CO2.

Specjalne podłoża:

-          podłoże Wrzoska – podłoże płynne z kawałkami wątroby

-          podłoże Hübnera z papką mózgową

-          podłoże Wróblewskiego z kłębkami waty

Po posianiu podłoże zalewamy parafiną w celu odcięcia dopływu tlenu.

Metody fizykochemiczne – wykorzystuje się aerostaty, na ich dnie znajdują się substancje pochłanaiające tlen na drodze reakcji chemicznej np. pirogallol i nadtlenek potasu.

Metody chemiczne – tlen ze środowiska usuwa się na drodze chemicznej. Wykorzystywana jest reakcja łączenia się tlenu i wodoru w obecności katalizatora palladowego w wyniku czego powstaje H2O.

Metody biologiczne:

1.      metoda Fortnera – obok materiału badanego, w którym podejrzewamy florę beztlenową, posiew się bakterie bezwzględnie tlenowe (np. Bacillus, Serratia marcesens). Płytkę uszczelniamy plasteliną lub parafiną. W I etapie rosną bakterie tlenowe dopóki obecny jest O2 w środowisku. Po wyczerpaniu O2 zaczynają rosnąć bakterie beztlenowe.

2.      coraz częściej wykorzystuje się podłoża z tioglikanem sodowym lub kwasem tioglikanowym, podłoża płynne zawierające związki, które obniżają potencjał oksydoredukcyjny umożliwiając wzrost bakterii beztlenowych.

Bakterie beztlenowe:

a)      przetrwalnikujące – Gram (+), laseczki z rodzaju Clostridium

b)     nieprzetrwalnikujące

§         Gram (+) – pałeczki (Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Actinomyces, Lactobacillus), ziarniaki (Peptostraptococcus)

§         Gram (-) – pałeczki (Bacteroides, Fuzobacterium, Porferomonas, Prevotella, Volinella, Mobilencus, Megamonas, Leptotrichia, Anaerospinylium, Centipeda), ziarniaki (Veilonella)

Bakterie beztlenowe nieprzetrwalnikujące to flora bakteryjna człowieka – błona śluzowa gardła, nosa, migdałków, także przewodu pokarmowego, dróg moczowo – płciowych. W niektórych miejscach stosunek bakterii beztlenowych do tlenowych u człowieka wynosi 1000:1.

Czynniki predysponujące do zakażeń bakteryjnych to:

-          upośledzenie mechanizmów odpornościowych

-          przerwanie ciągłości tkanki

-          urazy

-          inwazyjne metody leczenia (po zabiegach operacyjnych)

-          długotrwała antybiotykoterapia (zmiany ilościowe i jakościowe mikroflory człowieka na korzyść bakterii beztlenowych).

Zakażenia endogenne – bakterie beztlenowe.

Zakażenia egzogenne – zakażenia szpitalne.

Zakażenia endogenne – w obrębie miejsc naturalnego bytowania (zakażenia stomatologiczne – czynnik próchnicy, zapaleń przyzębia, ropnych zakażeń w obrębie jamy ustnej – ropnie okołozębowe).

Przyczyny przewlekłego zapalenia zatok i ucha środkowego, zakażenia oczu, zakrzepowe zapalenie żył, ropnie narządów wewnętrznych, płuc, wątroby, zapalenie jajników, otrzewnej, wyrostka robaczkowego. Mogą być przyczyną patologii ciąży, zakażenia skóry i tkanek miękkich, ropnych zapaleń stawów, kości i szpiku.

Materiały badane:

-          ropnie (ropnie głębokie – materiał pobrany igłą i strzykawką, po pobraniu igła zgięta lub zatkana, by nie było dopływu tlenu; ropnie powierzchniowe – wymazówka z dna zmiany ropnej) – transport w podłożu transportowym lub w próbówce z trioglikolanem

-          płyny ustrojowe (nie powinien być pobierany mocz ze środkowego strumienia, ale nakłucie pęcherza)

-          kał – przy zakażeniu  Clostridium

-          górne drogi oddechowe (aspiraty przedtchawiczne) lub materiały bezpostaciowe z płuc (bronchoskopia).

Preparaty z pobranych materiałów barwi się metodą Grama. Wykonuje się odczyn immunofluorescencji bezpośredniej. Przy wysiękach i płynach ustrojowych – chromatografia gazowo – cieczowa.

Podłożą hodowlane:

-          nieselektywne

-          selektywne

-          specjalne

Podłoża nieselektywne – najczęściej agar tryptozono – sojowy (TSA) lub  podłoże z krwią (5 % krwi króliczej lub baraniej z dodatkiem L- cystyny, wyciągu drożdżowego, witaminy K1 i treniny).

Podłoża selektywne – podłoże KV (kanamycyna i vankomycyna) – selektywne dla Bacteroides, Fusobacterium i Veilonella; podłoże PV (paramomycyna i vankomycyna) – selektywne dla Bacteroides fragilis, Prevotella, Porferomonas, Fusobacterium i Veilonella.

Inkubacja w temperaturze 35 – 37 stopni C przez 48 – 72 h, niektóre nawet do 96 h. Podłoża przetrzymuje się do 14 dni (Actinomyces, Propionibacterium, Eubacterium).

1