PCR_WWP_9_09.pdf

przewodnik...

Weterynaria W praktyce

dr Elisabeth Mueller, dr Antje Woeckener

chorób zakaźnych

u koni metodą pCr

W nowoczesnej diagnostyce wy-

krywanie patogenów metodą PCR

zastąpiło w znacznej części konwen-

cjonalne metody laboratoryjne.

konieczna jest jego krytyczna interpreta-

cja z uwzględnieniem aspektów klinicz-

nych. Pozytywny wynik badania PCR nie

dostarcza informacji o zdolności danego

patogenu do namnażania.

Materiał przeznaczony do badania

powinien być transportowany w steryl-

nych i neutralnych pojemnikach. Prób-

ki mogą być schłodzone (2-8°C), ale nie

jest to konieczne. Możliwe jest także za-

mrażanie próbek, ale po rozmrożeniu nie

wolno ich ponownie zamrażać.

Jeżeli materiał diagnostyczny stano-

wi krew, jako koagulantu należy użyć

EDTA lub cytrynianu sodu. Krew po-

brana na heparynę nie nadaje się do ba-

dania. Wymazy powinny być nadsyłane

bez podłoża transportowego.

Dalsza część poświęcona jest choro-

bom zakaźnym koni, w których wska-

zana jest diagnostyka metodą PCR.

Omówimy również materiał diagno-

styczny właściwy dla każdej z opisa-

nych chorób.

C horoby

wykonywane jest najczęściej na podsta-

wie próbek mazi stawowej, płynu mó-

zgowo-rdzeniowego, a także próbek

skóry. Badanie krwi jest mało skutecz-

ne, nawet w przypadku gorączki, ponie-

waż drobnoustrój ten rozprzestrzenia się

w tkankach, a nie poprzez krew.

Badania wykonywane techniką PCR po-

legają na powielaniu znanych sekwencji

aminokwasów patogenu do momentu,

w którym wyprodukowaną w ten spo-

sób ilość DNA można zmierzyć. Dzięki

temu metoda ta odznacza się bardzo wy-

soką wrażliwością i swoistością. Ponie-

waż istotą metody PCR jest izolacja DNA

bądź RNA patogenu, prawdopodobień-

stwo wykrycia patogenu w jednym bada-

niu jest znacznie wyższe niż w przypad-

ku technik polegających na izolowaniu

przeciwciał czy metod opartych na ho-

dowli drobnoustrojów. Po zakończeniu

leczenia zwierzęcia wynik badania PCR

powinien być negatywny.

Wysoka wrażliwość testów PCR wy-

maga staranności i dokładności pod-

czas pobierania próbek, ponieważ na-

wet najmniejsze zanieczyszczenie może

być przyczyną nieprawidłowego wyni-

ku. Pod względem transportowym testy

PCR są stosunkowo mało wymagające,

gdyż do ich wykonania nie jest koniecz-

na obecność patogenów zdolnych do na-

mnażania (jak to ma miejsce np. w ho-

dowli drobnoustrojów).

Istotne jest natomiast, aby lekarz we-

terynarii nadsyłający próbkę do badania

dokonał właściwego wyboru pod wzglę-

dem lokalizacji drobnoustroju. Na przy-

kład w przypadku wirusów i bakterii

będzie to krew, w przypadku zaatako-

wanych narządów – wymaz lub prób-

ka moczu itp., a w przypadku latencji

– próbki odpowiednich narządów, np.

węzłów chłonnych lub granulocytów.

Ponieważ technika PCR umożliwia ja-

kościowe wykrycie danego patogenu na-

wet przy jego niewielkiej ilości, w przy-

padku uzyskania pozytywnego wyniku

o podłożu bakteryjnym

Borelioza

Drobnoustrojem wywołującym w Euro-

pie tę przenoszoną przez kleszcze cho-

robę są przypuszczalnie trzy patogenne

gatunki krętka Borrelia z grupy Borrelia

burgdorferi sensu lato : B. burgdorferi sensu

stricto , B. afzelii i B. garinii .

Diagnostyka jest nadal bardzo trudna,

zwłaszcza że na obszarach endemicz-

nych bardzo wysoki poziom seroprewa-

lencji obserwuje się również w populacji

zdrowych koni. U koni krętkowi Borrelia

przypisuje się szereg różnych chorobo-

wych objawów klinicznych. Są to m.in.

zaburzenia o charakterze ogólnym, obja-

wy w obrębie stawów i kończyn, choro-

by skóry, oczu i serca, objawy ze strony

układu nerwowego, a także zaburzenia

płodności i poronienia. Równie zróżni-

cowana jest paleta potencjalnych mate-

riałów diagnostycznych. U koni badanie

Lawsonia intracellularis

Lawsonia intracellularis jest wewnątrz-

komórkową bakterią Gram-ujemną

i na przestrzeni ostatnich lat z punk-

tu widzenia diagnostyki różnicowej

jest coraz częściej uznawana za czyn-

nik odpowiedzialny za biegunki u źre-

biąt. Problem ten dotyczy głównie źre-

biąt odstawianych od klaczy, tj. w wieku

6-7 miesięcy, u których bakteria L. in-

tracellularis zagnieżdża się w komórkach

nabłonka krypt jelita krętego, wywołując

w obrębie jelit proliferacyjne stany pa-

tologiczne. Mogą one prowadzić do za-

burzeń wchłaniania jelitowego, a także

do chronicznych (z reguły) biegunek.

Choroba występuje najczęściej u poje-

dynczych zwierząt, jednak opisywano

również przypadki zachorowań u kilku

zwierząt w obrębie tej samej hodow-

li. Ponieważ w kale zakażonych zwie-

rząt znajduje się niewielka ilość tego

patogenu, badanie PCR z odchodów

stanowi jedynie pomocniczą alterna-

tywę, przy czym znikoma liczba drob-

noustrojów wydalanych tą drogą może

być przyczyną nieprawidłowego wyniku

negatywnego.

Leptospiroza

U koni zakażenia krętkiem Leptospi-

ra rozprzestrzeniającym się poprzez

mocz gryzoni przebiegają z reguły bez-

objawowo, co jest przyczyną wysokiej

seroprewalencji u koni zdrowych (ok.

75%). Drobnoustrój dostaje się do or-

ganizmu wraz z paszą lub wodą i może

wywoływać raczej niespecyiczne obja-

wy, takie jak gorączka (często z prze-

rwami), żółtaczka, brak łaknienia oraz

Wrzesień • 9/2009

www.weterynaria.elamed.pl

diagnostyka

przewodnik...

Weterynaria W praktyce

spadek wydajności. W literaturze opi-

sywano również poronienia. Zakażenia

przenoszone z konia na konia praktycz-

nie nie występują. Wyizolowanie DNA

patogenu w przypadku stanów choro-

bowych o charakterze ogólnym moż-

liwe jest na podstawie krwi pobranej

na EDTA, a w stanach chorobowych

o przebiegu chronicznym – na podsta-

wie moczu.

lence-associated protein A, vap A), które

odgrywa rolę w patogenezie rodokoko-

zy i uznawane jest za czynnik determi-

nujący zjadliwość.

dzieliny chorych zwierząt mogą służyć

jako materiał do badania RNA. U zwie-

rząt chorych i gorączkujących RNA pa-

togenu udaje się często wyizolować tak-

że z krwi pobranej na EDTA.

Streptococcus equi (zołzy)

Zołzy to szeroko rozpowszechniona,

ostra, zakaźna choroba przejawiająca

się ropnym zapaleniem węzłów chłon-

nych i zapaleniem gardła. Jest typowa dla

młodych koni i prowadzi do długotrwa-

łego uodpornienia, dlatego rzadko wy-

stępuje u starszych zwierząt. Do izolacji

DNA bądź patogenu służą głównie wy-

mazy z nozdrzy, wydzielina tchawicowo-

-oskrzelowa lub ropa z ropnia. W tym

przypadku przewaga metody PCR nad

hodowlą polega na tym, że PCR pozwala

na szybsze uzyskanie wyniku przy jed-

nocześnie wyższej wrażliwości i specy-

iczności, umożliwia trafniejszą identyf-

kację zwierząt klinicznie zdrowych, lecz

będących nosicielami patogenu, które

odgrywają kluczową rolę w epidemio-

logii tego drobnoustroju.

Ponieważ metoda PCR nie odróżnia

martwych i żywych drobnoustrojów,

uzyskany wynik pozytywny należy za-

wsze traktować jako podejrzenie i po-

twierdzić hodowlą.

C horoby w ir u s ow e

Wirusowe zapalenie tętnic

u koni (EVA)

Wirusowe zapalenie tętnic ( equine viral

arteritis ) jest chorobą zakaźną o global-

nym zasięgu, występującą u koniowa-

tych i wywoływaną przez wirus EAV,

czyli wirus zapalenia tętnic. Wydaje

się, iż liczba potwierdzonych przypad-

ków tej choroby wzrosła w ciągu ostat-

nich lat. Większość zakażeń nabytych

drogą naturalną przebiega subklinicz-

nie, mimo to dochodzi do serokonwer-

sji. Objawy, o ile wystąpią, są zróżnico-

wane pod względem rodzaju i natężenia.

Do możliwych należą: gorączka, depre-

sja, jadłowstręt, obwodowe obrzęki, za-

palenie spojówek, pokrzywka, poronie-

nia, a u zwierząt młodych także nagłe

zapalenia płuc oraz jednoczesne zapale-

nia płuc i jelit. Wirus przenosi się głów-

nie poprzez nasienie, gdyż zagnieżdża

się w dodatkowych gruczołach płcio-

wych zakażonych ogierów, skąd jest

z przerwami wydalany wraz z wydzie-

linami narządów płciowych. Wałachy,

konie w fazie dojrzewania i klacze nie

mogą być zdrowymi nosicielami. Chore

zwierząte mogą wydzielać wirusa rów-

nież z innymi wydzielinami ustrojowy-

mi, m.in. z rozpyloną wydzieliną dróg

oddechowych, z moczem lub z mate-

riałem poronnym. Podobnie jak sper-

ma ogierów, również wspomniane wy-

Herpeswirus koni typu 1

i typu 4 (EHV1 i EHV4)

Zakażenia herpeswirusem koni typu 1 i 4

są z reguły przyczyną chorób dróg od-

dechowych, przy czym natężenie obja-

wów klinicznych uzależnione jest zwy-

kle od wieku i statusu immunologicznego

zakażonego zwierzęcia. Zakażenia herpe-

swirusem typu 1 mogą rozprzestzrzeniać

się również poza obszar błon śluzowych

dróg oddechowych i wywoływać cięż-

sze objawy choroby, takie jak poronie-

nia, okołoporodowy zgon źrebięcia czy

choroby układu nerwowego. Raz zaka-

żone zwierzę staje się nosicielem wirusa

na całe życie, przy czym w wyniku dzia-

łania czynników wewnątrzpochodnych

i w niekorzystnych warunkach wirus

może się ponownie uaktywniać (na przy-

kład w sytuacjach stresowych). Obszara-

mi utajnienia wirusa są głównie narzą-

dy limfatyczne oraz frakcje leukocytów.

Do badania PCR nadają się najlepiej wy-

mazy z nozdrzy i wydzieliny z dróg od-

dechowych, płyn mózgowo-rdzeniowy,

a także materiał poronny, w tym rów-

nież łożysko. Krew może być przedmio-

tem badania jedynie w drugiej kolejności

i tylko w fazie gorączki. Jako że frakcje

leukocytów, o czym wspomniano już

wcześniej, mogą stanowić obszar laten-

cji herpeswirusa, można pokusić się rów-

nież o badanie koncentratu bogatopłytko-

wego. Pozytywny wynik takiego badania

pozwala w znacznym stopniu na stwier-

dzenie, iż badane zwierzę miało kontakt

z herpeswirusem. Nie pozwala jednak

na określenie, czy mamy do czynienia

z ostrym przypadkiem, czy ze starszym

zakażeniem. Natomiast w przypadku

młodych zwierząt skuteczne może oka-

zać się badanie krwi.

Nawracające zapalenie błony

naczyniowej oka u koni (ERU)

Dowiedziono, iż istnieje związek pomię-

dzy trwałą wewnątrzgałkową infekcją

krętkiem Leptospira a nawracającym za-

paleniem błony naczyniowej oka u koni,

określanym również mianem ślepoty

miesięcznej. Wynikające z tego reakcje

autoimmunologiczne prowadzą do po-

stępującego uszkodzenia wewnętrznych

struktur oka, a nawet do oślepnięcia. Na-

wracające zapalenie błony naczyniowej

można stwierdzić na podstawie badania

w kierunku przeciwciał (jest to najczul-

sza metoda), ale także poprzez wyizo-

lowanie antygenu metodą PCR z pły-

nu śródgałkowego bądź z próbki ciała

szklistego. Należy zaznaczyć, że miano

przeciwciał w surowicy nie ma znacze-

nia w przypadku ERU.

Rhodococcus equi

Rhodococcus equi jest bakterią warunko-

wo chorobotwórczą występującą w gle-

bie oraz w kale koni. To najczęstsza

przyczyna ciężkich zapaleń płuc pro-

wadzących do zgonów u źrebiąt w wie-

ku od 3 tygodni do 6 miesięcy. Wrotami

zakażenia i głównym miejscem bytowa-

nia drobnoustroju są płuca (w których

tworzą się ropnie), skąd może ono roz-

przestrzeniać się wraz z krwią do in-

nych narządów. Druga potencjalna dro-

ga zakażena to przewód pokarmowy

(biegunki, wrzody), a także pępek. Po-

nadto R. equi wykazuje powinowactwo

z kośćmi i stawami. W przypadku ob-

jawów płucnych materiałem do badania

może być wymaz z nozdrza lub popłu-

czyny z tchawicy. Ze względu na wyso-

ką wrażliwość metoda PCR umożliwia

także identyikację klinicznie zdrowych

nosicieli. Ponieważ R. equi jako bak-

teria glebowa występuje praktycznie

wszędzie, w tym również u innych ga-

tunków (także u ludzi), nasze laborato-

rium wykonuje badanie PCR w dwóch

etapach, izolując w drugim etapie biał-

ko vap A, czyli tzw. sekwencję plazmi-

du zjadliwości, co pozwala na szybkie

i prawidłowe wykrycie szczepów R. equi

specyicznych dla koni. Plazmid ten od-

powiedzialny jest za kodowanie biał-

ka A związanego ze zjadliwością ( viru-

Końska grypa (bold)

Końską grypę wywołują dwa podtypy

wirusa końskiej grypy typu A: podtyp 1

(H7N7) i podtyp 2 (H3N8), przy czym

podtyp 1 w ciągu ostatnich 30 lat wy-

stępował bardzo rzadko. U koniowatych

podatnych na tego wirusa w następstwie

zakażenia pojawia się gorączka i suchy

kaszel. W nieszczepionych populacjach

wirus rozprzestrzenia się bardzo szybko.

Zakażeniu towarzyszą często bakteryjne

infekcje wtórne objawiające się śluzowo-

ropną wydzieliną z nozdrzy i maskujące

obraz kliniczny, co ma miejsce głównie

w populacjach mających częściową od-

porność. Szybką i prawidłową diagnozę

Wrzesień • 9/2009

www.weterynaria.elamed.pl

Weterynaria W praktyce

przewodnik...

umożliwia badanie PCR wymazu z noz-

drza, popłuczyn z tchawicy lub popłu-

czyn oskrzelowo-pęcherzykowych.

p asożyty k rw i

Theileria equi / Babesia caballi

– babeszjoza (piroplazmoza)

Babeszjoza (piroplazmoza) koni jest

chorobą wywoływaną przez pierwot-

niaka przenoszonego przez kleszcze.

Obszarem endemii jest większość re-

gionów tropikalnych i subtropikalnych,

choć sięga on także do stref umiarko-

wanych. W związku z powszechnością

transportu koni oraz rozszerzaniem

się obszarów występowania wektorów

choroby obecnie należy się liczyć z tym,

iż przypadki kliniczne, a także zwierzę-

ta seropozytywne będą coraz częstszym

zjawiskiem również w naszym kraju.

Chorobę wywołuje pierwotniak Ba-

besia caballi, względnie Theileria equi ,

którego obecność można stwierdzić

w czerwonych krwinkach zakażonych

zwierząt. Objawy kliniczne mają często

charakter nieswoisty, a choroba może

mieć przebieg zarówno bardzo ostry,

jak i przewlekły. Do charakterystycz-

nych objawów należą: gorączka (często

z przerwami), brak łaknienia, przyspie-

szony oddech i tętno, stany depresyj-

ne, żółtaczka i obecność hemoglobi-

ny w moczu, a w postaci przewlekłej

– utrata wagi. Zakażone zwierzęta pozo-

stają przez długi czas nosicielami, sta-

nowiąc źródło zakażenia dla wektorów.

Materiałem do badania PCR jest krew

pobrana na EDTA. W pierwszym eta-

pie badanie prowadzone jest pod kątem

obecności obu pierwotniaków, tj. B. ca-

balli i T. equi . Jeżeli wynik jest pozytyw-

ny, metodą sekwencjonowania można

dokładnie określić, czy mamy do czy-

nienia z B. caballi , czy T. equi .

serwuje się małopłytkowość, lekką nie-

dokrwistość i wysoki poziom bilirubiny.

U zwierząt dorosłych w wieku powyżej

4 lat objawy są znacznie bardziej wy-

raźne niż u młodych koni. Po przebytej

chorobie koń nabywa odporność utrzy-

mującą się przez ok. 2 lata, niezależnie

od tego, czy zakażenie jest utajone, czy

zwierzę jest nosicielem.

Badanie DNA wykonuje się na pod-

stawie krwi chorego zwierzęcia pobra-

nej na EDTA ok. 5 dni po wniknięciu

patogenu do organizmu, czyli w mo-

mencie wystąpienia gorączki, natomiast

wykrycie pasożyta metodą mikroskopo-

wą możliwe jest dopiero po upływie ok.

5 dni od wystapienia gorączki. q

Anaplazmoza (erlichioza)

Patogenem odpowiedzialnym za er-

lichiozę granulocytarną u koni jest

Anaplasma phagocytophilum (wcześniej

Ehrlichia equi ). Jest to Gram-ujemna

bakteria bezwzględnie wewnątrzkomór-

kowa o ziarenkowatym kształcie, prze-

noszona przez kleszcze, która stanowi

poważny problem w Europie. Drobno-

ustrój po wniknięciu do organizmu roz-

przestrzenia się wraz z limfą i krwią,

a następnie zasiedla komórki docelo-

we, czyli granulocyty obojętnochłonne

i eozynoilne. Początkowo infekcja ob-

jawia się gorączką, apatią, obrzękiem

kończym i awersją do ruchu. Z punktu

widzenia diagnostyki laboratoryjnej ob-

dr Elisabeth Mueller

dr Antje Woeckener

Laboklin Polska Sp. z o.o.

01-495 Warszawa

ul. Powstańców Śląskich 101

tel. 0 800 100 101

tel. 022 691 93 10-12

e-mail: lab.warszawa@laboklin.pl

reklama

Wrzesień • 9/2009

www.weterynaria.elamed.pl

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: