PCR_WWP_9_09.pdf
(
117 KB
)
Pobierz
273236446 UNPDF
przewodnik...
Weterynaria W praktyce
dr Elisabeth Mueller, dr Antje Woeckener
chorób zakaźnych
u koni metodą pCr
W nowoczesnej diagnostyce wy-
krywanie patogenów metodą PCR
zastąpiło w znacznej części konwen-
cjonalne metody laboratoryjne.
konieczna jest jego krytyczna interpreta-
cja z uwzględnieniem aspektów klinicz-
nych. Pozytywny wynik badania PCR nie
dostarcza informacji o zdolności danego
patogenu do namnażania.
Materiał przeznaczony do badania
powinien być transportowany w steryl-
nych i neutralnych pojemnikach. Prób-
ki mogą być schłodzone (2-8°C), ale nie
jest to konieczne. Możliwe jest także za-
mrażanie próbek, ale po rozmrożeniu nie
wolno ich ponownie zamrażać.
Jeżeli materiał diagnostyczny stano-
wi krew, jako koagulantu należy użyć
EDTA lub cytrynianu sodu. Krew po-
brana na heparynę nie nadaje się do ba-
dania. Wymazy powinny być nadsyłane
bez podłoża transportowego.
Dalsza część poświęcona jest choro-
bom zakaźnym koni, w których wska-
zana jest diagnostyka metodą PCR.
Omówimy również materiał diagno-
styczny właściwy dla każdej z opisa-
nych chorób.
C
horoby
wykonywane jest najczęściej na podsta-
wie próbek mazi stawowej, płynu mó-
zgowo-rdzeniowego, a także próbek
skóry. Badanie krwi jest mało skutecz-
ne, nawet w przypadku gorączki, ponie-
waż drobnoustrój ten rozprzestrzenia się
w tkankach, a nie poprzez krew.
Badania wykonywane techniką PCR po-
legają na powielaniu znanych sekwencji
aminokwasów patogenu do momentu,
w którym wyprodukowaną w ten spo-
sób ilość DNA można zmierzyć. Dzięki
temu metoda ta odznacza się bardzo wy-
soką wrażliwością i swoistością. Ponie-
waż istotą metody PCR jest izolacja DNA
bądź RNA patogenu, prawdopodobień-
stwo wykrycia patogenu w jednym bada-
niu jest znacznie wyższe niż w przypad-
ku technik polegających na izolowaniu
przeciwciał czy metod opartych na ho-
dowli drobnoustrojów. Po zakończeniu
leczenia zwierzęcia wynik badania PCR
powinien być negatywny.
Wysoka wrażliwość testów PCR wy-
maga staranności i dokładności pod-
czas pobierania próbek, ponieważ na-
wet najmniejsze zanieczyszczenie może
być przyczyną nieprawidłowego wyni-
ku. Pod względem transportowym testy
PCR są stosunkowo mało wymagające,
gdyż do ich wykonania nie jest koniecz-
na obecność patogenów zdolnych do na-
mnażania (jak to ma miejsce np. w ho-
dowli drobnoustrojów).
Istotne jest natomiast, aby lekarz we-
terynarii nadsyłający próbkę do badania
dokonał właściwego wyboru pod wzglę-
dem lokalizacji drobnoustroju. Na przy-
kład w przypadku wirusów i bakterii
będzie to krew, w przypadku zaatako-
wanych narządów – wymaz lub prób-
ka moczu itp., a w przypadku latencji
– próbki odpowiednich narządów, np.
węzłów chłonnych lub granulocytów.
Ponieważ technika PCR umożliwia ja-
kościowe wykrycie danego patogenu na-
wet przy jego niewielkiej ilości, w przy-
padku uzyskania pozytywnego wyniku
o
podłożu
bakteryjnym
Borelioza
Drobnoustrojem wywołującym w Euro-
pie tę przenoszoną przez kleszcze cho-
robę są przypuszczalnie trzy patogenne
gatunki krętka
Borrelia
z grupy
Borrelia
burgdorferi sensu lato
:
B. burgdorferi sensu
stricto
,
B. afzelii
i
B. garinii
.
Diagnostyka jest nadal bardzo trudna,
zwłaszcza że na obszarach endemicz-
nych bardzo wysoki poziom seroprewa-
lencji obserwuje się również w populacji
zdrowych koni. U koni krętkowi
Borrelia
przypisuje się szereg różnych chorobo-
wych objawów klinicznych. Są to m.in.
zaburzenia o charakterze ogólnym, obja-
wy w obrębie stawów i kończyn, choro-
by skóry, oczu i serca, objawy ze strony
układu nerwowego, a także zaburzenia
płodności i poronienia. Równie zróżni-
cowana jest paleta potencjalnych mate-
riałów diagnostycznych. U koni badanie
Lawsonia intracellularis
Lawsonia intracellularis
jest wewnątrz-
komórkową bakterią Gram-ujemną
i na przestrzeni ostatnich lat z punk-
tu widzenia diagnostyki różnicowej
jest coraz częściej uznawana za czyn-
nik odpowiedzialny za biegunki u źre-
biąt. Problem ten dotyczy głównie źre-
biąt odstawianych od klaczy, tj. w wieku
6-7 miesięcy, u których bakteria
L. in-
tracellularis
zagnieżdża się w komórkach
nabłonka krypt jelita krętego, wywołując
w obrębie jelit proliferacyjne stany pa-
tologiczne. Mogą one prowadzić do za-
burzeń wchłaniania jelitowego, a także
do chronicznych (z reguły) biegunek.
Choroba występuje najczęściej u poje-
dynczych zwierząt, jednak opisywano
również przypadki zachorowań u kilku
zwierząt w obrębie tej samej hodow-
li. Ponieważ w kale zakażonych zwie-
rząt znajduje się niewielka ilość tego
patogenu, badanie PCR z odchodów
stanowi jedynie pomocniczą alterna-
tywę, przy czym znikoma liczba drob-
noustrojów wydalanych tą drogą może
być przyczyną nieprawidłowego wyniku
negatywnego.
Leptospiroza
U koni zakażenia krętkiem
Leptospi-
ra
rozprzestrzeniającym się poprzez
mocz gryzoni przebiegają z reguły bez-
objawowo, co jest przyczyną wysokiej
seroprewalencji u koni zdrowych (ok.
75%). Drobnoustrój dostaje się do or-
ganizmu wraz z paszą lub wodą i może
wywoływać raczej niespecyiczne obja-
wy, takie jak gorączka (często z prze-
rwami), żółtaczka, brak łaknienia oraz
56
Wrzesień • 9/2009
www.weterynaria.elamed.pl
diagnostyka
przewodnik...
Weterynaria W praktyce
spadek wydajności. W literaturze opi-
sywano również poronienia. Zakażenia
przenoszone z konia na konia praktycz-
nie nie występują. Wyizolowanie DNA
patogenu w przypadku stanów choro-
bowych o charakterze ogólnym moż-
liwe jest na podstawie krwi pobranej
na EDTA, a w stanach chorobowych
o przebiegu chronicznym – na podsta-
wie moczu.
lence-associated protein
A, vap A), które
odgrywa rolę w patogenezie rodokoko-
zy i uznawane jest za czynnik determi-
nujący zjadliwość.
dzieliny chorych zwierząt mogą służyć
jako materiał do badania RNA. U zwie-
rząt chorych i gorączkujących RNA pa-
togenu udaje się często wyizolować tak-
że z krwi pobranej na EDTA.
Streptococcus equi
(zołzy)
Zołzy to szeroko rozpowszechniona,
ostra, zakaźna choroba przejawiająca
się ropnym zapaleniem węzłów chłon-
nych i zapaleniem gardła. Jest typowa dla
młodych koni i prowadzi do długotrwa-
łego uodpornienia, dlatego rzadko wy-
stępuje u starszych zwierząt. Do izolacji
DNA bądź patogenu służą głównie wy-
mazy z nozdrzy, wydzielina tchawicowo-
-oskrzelowa lub ropa z ropnia. W tym
przypadku przewaga metody PCR nad
hodowlą polega na tym, że PCR pozwala
na szybsze uzyskanie wyniku przy jed-
nocześnie wyższej wrażliwości i specy-
iczności, umożliwia trafniejszą identyf-
kację zwierząt klinicznie zdrowych, lecz
będących nosicielami patogenu, które
odgrywają kluczową rolę w epidemio-
logii tego drobnoustroju.
Ponieważ metoda PCR nie odróżnia
martwych i żywych drobnoustrojów,
uzyskany wynik pozytywny należy za-
wsze traktować jako podejrzenie i po-
twierdzić hodowlą.
C
horoby
w ir u s ow e
Wirusowe zapalenie tętnic
u koni (EVA)
Wirusowe zapalenie tętnic (
equine viral
arteritis
) jest chorobą zakaźną o global-
nym zasięgu, występującą u koniowa-
tych i wywoływaną przez wirus EAV,
czyli wirus zapalenia tętnic. Wydaje
się, iż liczba potwierdzonych przypad-
ków tej choroby wzrosła w ciągu ostat-
nich lat. Większość zakażeń nabytych
drogą naturalną przebiega subklinicz-
nie, mimo to dochodzi do serokonwer-
sji. Objawy, o ile wystąpią, są zróżnico-
wane pod względem rodzaju i natężenia.
Do możliwych należą: gorączka, depre-
sja, jadłowstręt, obwodowe obrzęki, za-
palenie spojówek, pokrzywka, poronie-
nia, a u zwierząt młodych także nagłe
zapalenia płuc oraz jednoczesne zapale-
nia płuc i jelit. Wirus przenosi się głów-
nie poprzez nasienie, gdyż zagnieżdża
się w dodatkowych gruczołach płcio-
wych zakażonych ogierów, skąd jest
z przerwami wydalany wraz z wydzie-
linami narządów płciowych. Wałachy,
konie w fazie dojrzewania i klacze nie
mogą być zdrowymi nosicielami. Chore
zwierząte mogą wydzielać wirusa rów-
nież z innymi wydzielinami ustrojowy-
mi, m.in. z rozpyloną wydzieliną dróg
oddechowych, z moczem lub z mate-
riałem poronnym. Podobnie jak sper-
ma ogierów, również wspomniane wy-
Herpeswirus koni typu 1
i typu 4 (EHV1 i EHV4)
Zakażenia herpeswirusem koni typu 1 i 4
są z reguły przyczyną chorób dróg od-
dechowych, przy czym natężenie obja-
wów klinicznych uzależnione jest zwy-
kle od wieku i statusu immunologicznego
zakażonego zwierzęcia. Zakażenia herpe-
swirusem typu 1 mogą rozprzestzrzeniać
się również poza obszar błon śluzowych
dróg oddechowych i wywoływać cięż-
sze objawy choroby, takie jak poronie-
nia, okołoporodowy zgon źrebięcia czy
choroby układu nerwowego. Raz zaka-
żone zwierzę staje się nosicielem wirusa
na całe życie, przy czym w wyniku dzia-
łania czynników wewnątrzpochodnych
i w niekorzystnych warunkach wirus
może się ponownie uaktywniać (na przy-
kład w sytuacjach stresowych). Obszara-
mi utajnienia wirusa są głównie narzą-
dy limfatyczne oraz frakcje leukocytów.
Do badania PCR nadają się najlepiej wy-
mazy z nozdrzy i wydzieliny z dróg od-
dechowych, płyn mózgowo-rdzeniowy,
a także materiał poronny, w tym rów-
nież łożysko. Krew może być przedmio-
tem badania jedynie w drugiej kolejności
i tylko w fazie gorączki. Jako że frakcje
leukocytów, o czym wspomniano już
wcześniej, mogą stanowić obszar laten-
cji herpeswirusa, można pokusić się rów-
nież o badanie koncentratu bogatopłytko-
wego. Pozytywny wynik takiego badania
pozwala w znacznym stopniu na stwier-
dzenie, iż badane zwierzę miało kontakt
z herpeswirusem. Nie pozwala jednak
na określenie, czy mamy do czynienia
z ostrym przypadkiem, czy ze starszym
zakażeniem. Natomiast w przypadku
młodych zwierząt skuteczne może oka-
zać się badanie krwi.
Nawracające zapalenie błony
naczyniowej oka u koni (ERU)
Dowiedziono, iż istnieje związek pomię-
dzy trwałą wewnątrzgałkową infekcją
krętkiem
Leptospira
a nawracającym za-
paleniem błony naczyniowej oka u koni,
określanym również mianem ślepoty
miesięcznej. Wynikające z tego reakcje
autoimmunologiczne prowadzą do po-
stępującego uszkodzenia wewnętrznych
struktur oka, a nawet do oślepnięcia. Na-
wracające zapalenie błony naczyniowej
można stwierdzić na podstawie badania
w kierunku przeciwciał (jest to najczul-
sza metoda), ale także poprzez wyizo-
lowanie antygenu metodą PCR z pły-
nu śródgałkowego bądź z próbki ciała
szklistego. Należy zaznaczyć, że miano
przeciwciał w surowicy nie ma znacze-
nia w przypadku ERU.
Rhodococcus equi
Rhodococcus equi
jest bakterią warunko-
wo chorobotwórczą występującą w gle-
bie oraz w kale koni. To najczęstsza
przyczyna ciężkich zapaleń płuc pro-
wadzących do zgonów u źrebiąt w wie-
ku od 3 tygodni do 6 miesięcy. Wrotami
zakażenia i głównym miejscem bytowa-
nia drobnoustroju są płuca (w których
tworzą się ropnie), skąd może ono roz-
przestrzeniać się wraz z krwią do in-
nych narządów. Druga potencjalna dro-
ga zakażena to przewód pokarmowy
(biegunki, wrzody), a także pępek. Po-
nadto
R. equi
wykazuje powinowactwo
z kośćmi i stawami. W przypadku ob-
jawów płucnych materiałem do badania
może być wymaz z nozdrza lub popłu-
czyny z tchawicy. Ze względu na wyso-
ką wrażliwość metoda PCR umożliwia
także identyikację klinicznie zdrowych
nosicieli. Ponieważ
R. equi
jako bak-
teria glebowa występuje praktycznie
wszędzie, w tym również u innych ga-
tunków (także u ludzi), nasze laborato-
rium wykonuje badanie PCR w dwóch
etapach, izolując w drugim etapie biał-
ko vap A, czyli tzw. sekwencję plazmi-
du zjadliwości, co pozwala na szybkie
i prawidłowe wykrycie szczepów
R. equi
specyicznych dla koni. Plazmid ten od-
powiedzialny jest za kodowanie biał-
ka A związanego ze zjadliwością (
viru-
Końska grypa (bold)
Końską grypę wywołują dwa podtypy
wirusa końskiej grypy typu A: podtyp 1
(H7N7) i podtyp 2 (H3N8), przy czym
podtyp 1 w ciągu ostatnich 30 lat wy-
stępował bardzo rzadko. U koniowatych
podatnych na tego wirusa w następstwie
zakażenia pojawia się gorączka i suchy
kaszel. W nieszczepionych populacjach
wirus rozprzestrzenia się bardzo szybko.
Zakażeniu towarzyszą często bakteryjne
infekcje wtórne objawiające się śluzowo-
ropną wydzieliną z nozdrzy i maskujące
obraz kliniczny, co ma miejsce głównie
w populacjach mających częściową od-
porność. Szybką i prawidłową diagnozę
58
Wrzesień • 9/2009
www.weterynaria.elamed.pl
Weterynaria W praktyce
przewodnik...
umożliwia badanie PCR wymazu z noz-
drza, popłuczyn z tchawicy lub popłu-
czyn oskrzelowo-pęcherzykowych.
p
asożyty
k rw i
Theileria equi
/
Babesia caballi
– babeszjoza (piroplazmoza)
Babeszjoza (piroplazmoza) koni jest
chorobą wywoływaną przez pierwot-
niaka przenoszonego przez kleszcze.
Obszarem endemii jest większość re-
gionów tropikalnych i subtropikalnych,
choć sięga on także do stref umiarko-
wanych. W związku z powszechnością
transportu koni oraz rozszerzaniem
się obszarów występowania wektorów
choroby obecnie należy się liczyć z tym,
iż przypadki kliniczne, a także zwierzę-
ta seropozytywne będą coraz częstszym
zjawiskiem również w naszym kraju.
Chorobę wywołuje pierwotniak
Ba-
besia caballi,
względnie
Theileria equi
,
którego obecność można stwierdzić
w czerwonych krwinkach zakażonych
zwierząt. Objawy kliniczne mają często
charakter nieswoisty, a choroba może
mieć przebieg zarówno bardzo ostry,
jak i przewlekły. Do charakterystycz-
nych objawów należą: gorączka (często
z przerwami), brak łaknienia, przyspie-
szony oddech i tętno, stany depresyj-
ne, żółtaczka i obecność hemoglobi-
ny w moczu, a w postaci przewlekłej
– utrata wagi. Zakażone zwierzęta pozo-
stają przez długi czas nosicielami, sta-
nowiąc źródło zakażenia dla wektorów.
Materiałem do badania PCR jest krew
pobrana na EDTA. W pierwszym eta-
pie badanie prowadzone jest pod kątem
obecności obu pierwotniaków, tj.
B. ca-
balli
i
T. equi
. Jeżeli wynik jest pozytyw-
ny, metodą sekwencjonowania można
dokładnie określić, czy mamy do czy-
nienia z
B. caballi
, czy
T. equi
.
serwuje się małopłytkowość, lekką nie-
dokrwistość i wysoki poziom bilirubiny.
U zwierząt dorosłych w wieku powyżej
4 lat objawy są znacznie bardziej wy-
raźne niż u młodych koni. Po przebytej
chorobie koń nabywa odporność utrzy-
mującą się przez ok. 2 lata, niezależnie
od tego, czy zakażenie jest utajone, czy
zwierzę jest nosicielem.
Badanie DNA wykonuje się na pod-
stawie krwi chorego zwierzęcia pobra-
nej na EDTA ok. 5 dni po wniknięciu
patogenu do organizmu, czyli w mo-
mencie wystąpienia gorączki, natomiast
wykrycie pasożyta metodą mikroskopo-
wą możliwe jest dopiero po upływie ok.
5 dni od wystapienia gorączki.
q
Anaplazmoza (erlichioza)
Patogenem odpowiedzialnym za er-
lichiozę granulocytarną u koni jest
Anaplasma phagocytophilum
(wcześniej
Ehrlichia equi
). Jest to Gram-ujemna
bakteria bezwzględnie wewnątrzkomór-
kowa o ziarenkowatym kształcie, prze-
noszona przez kleszcze, która stanowi
poważny problem w Europie. Drobno-
ustrój po wniknięciu do organizmu roz-
przestrzenia się wraz z limfą i krwią,
a następnie zasiedla komórki docelo-
we, czyli granulocyty obojętnochłonne
i eozynoilne. Początkowo infekcja ob-
jawia się gorączką, apatią, obrzękiem
kończym i awersją do ruchu. Z punktu
widzenia diagnostyki laboratoryjnej ob-
dr Elisabeth Mueller
dr Antje Woeckener
Laboklin Polska Sp. z o.o.
01-495 Warszawa
ul. Powstańców Śląskich 101
tel. 0 800 100 101
tel. 022 691 93 10-12
e-mail: lab.warszawa@laboklin.pl
reklama
Wrzesień • 9/2009
59
www.weterynaria.elamed.pl
Plik z chomika:
Weterynaria3288
Inne pliki z tego folderu:
Powszechnie wystepujace choroby gadow i ich terapia.pdf
(11078 KB)
Biology of marine birds.pdf
(13213 KB)
Veterinary Toxicology (Practical).pdf
(2580 KB)
Postępowanie w nagłych przypadkach okulistycznych u zwierząt - D.L. Williams, K. Barrie, T.F. Evans(1).pdf
(11843 KB)
weterynaria_artykul_choroby powiek małych zwierząt cz.I.pdf
(803 KB)
Inne foldery tego chomika:
bajki
Dokumenty
Galeria
Prywatne
zachomikowane
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin