Podstawy biochemii.pdf

BIOCHEMIA

(wersja mała)

Materiały do ćwiczeń dla studentów Wydziału Biologii (kierunek Ochrona Środowiska)

PODSTAWY BIOCHEMII

dla

OCHRONY ŚRODOWISKA

Materiały do ćwiczeń dla studentów Międzywydziałowych Studiów Ochrony Środowiska

Rafał Derlacz, Agnieszka Girstun, Barbara Kowalska-Loth, Piotr Kozłowski,

Agnieszka Piekiełko-Witkowska, Anna Szakiel i Joanna Trzcińska-Danielewicz

Uniwersytet Warszawski

Wydział Biologii

Instytut Biochemii

Warszawa, 2008

wersja 6.0

przygotowano przy użyciu pakietu biurowego OpenOffice.org 2.3

wydrukowano na papierze z odzysku

udostępniono w formie elektronicznej na www.biol.uw.edu.pl/zbm

Wstęp

Biochemia bada właściwości i przemiany związków (głównie organicznych) występujących w żywych

komórkach, przybliżając nas do zrozumienia fenomenu jakim jest Życie. Zakres materiału przestawiany w ramach

niniejszych ćwiczeń jest próbą kompromisu między olbrzymim dorobkiem tej dziedziny nauki, a bardzo krótkim

czasem przeznaczonym na jedyny, dla większości biorących w nich udział studentów, kontakt z tego typu

przedmiotem w trakcie toku studiów, przy dodatkowym uwzględnieniu specyfiki wybranego przez nich kierunku -

Ochrony środowiska.

W trakcie ćwiczeń przedstawione zostaną właściwości wszystkich głównych grup tych związków organicznych:

białek wraz z aminokwasami i peptydami, kwasów nukleinowych wraz z nukleotydami, węglowodanów i lipidów,

którym poświęcone będą cztery zajęcia. Dwa osobne zajęcia przeznaczone będą dla wybranych, ze względu na

swoje fundamentalne znaczenie, grup białek: enzymów, warunkujących przemiany wszystkich tych związków w

żywej komórce oraz przeciwciał, nadających organizmom odporność na choroby. Studenci zapoznają się również

z ważniejszymi technikami stosowanymi w badaniach biochemicznych, z których niektóre używane są także w

diagnostyce medycznej, kryminalistyce, przemyśle spożywczym lub farmaceutycznym: chromatografią żelową,

chromatografią cienkowarstwową adsorpcyjną, dializą, denaturującą elektroforezą białek, niespecyficznym

barwieniem białek, immunoblotingiem, łańcuchową reakcją polimerazy (PCR), elektroforezą kwasów

nukleinowych, niespecyficznym barwieniem kwasów nukleinowych, spektrofotometrią, biochemicznym

oznaczeniem zawartości substancji, otrzymywaniem substancji z materiału biologicznego oraz badaniem

aktywności enzymów.

Ćwiczenia zaplanowano do wykonywania w 2-4 osobowych zespołach. W przypadku każdego ćwiczenia,

część praktyczna poprzedzona jest teoretycznym wstępem. Jego zadaniem jest jednak jedynie wprowadzenie w

dane zagadnienie i w żadnym wypadku nie zastąpi on stosownych rozdziałów z książek podanych w spisie

literatury. Pod koniec opisu każdego ćwiczenia przewidziano miejsce na wpisanie najważniejszych wyników z

przeprowadzonych eksperymentów. W trakcie wykonywania ćwiczeń, studenci będą mieli kontakt z

niebezpiecznymi substancjami. Z tego względu, wymagane jest zapoznanie się i przestrzeganie podanego

regulaminu w pełnym jego zakresie. W trakcie pracy z roztworami będą używane pipety automatyczne. Ich

obsługa jest opisana w oddzielnej instrukcji. W przypadku wykonywania rozcieńczeń lub określania ilości

substancji w objętości roztworu o znanym jej stężeniu molowym, pomocne będą umieszczone w skrypcie

przykłady obliczeń biochemicznych.

Spis treści

Ćw. 1. Aminokwasy, peptydy i białka ......................................................................................................................... 1

Ćw. 2. Przeciwciała ..................................................................................................................................................... 7

Ćw. 3. Węglowodany ................................................................................................................................................ 12

Ćw. 4. Nukleotydy i kwasy nukleinowe .................................................................................................................... 17

Ćw. 5. Lipidy ............................................................................................................................................................. 23

Ćw. 6. Enzymy .......................................................................................................................................................... 28

Regulamin ćwiczeń ................................................................................................................................................... 32

Spis literatury ............................................................................................................................................................ 32

Obsługa pipet automatycznych ................................................................................ wewnętrzna strona tylnej okładki

Obliczenia biochemiczne ......................................................................................... wewnętrzna strona tylnej okładki

Biochemia (wersja mała) / Podstawy biochemii dla ochrony środowiska

Ćw. 1. AMINOKWASY, PEPTYDY i BIAŁKA

Aminokwasy

Aminokwasy są to związki drobnocząsteczkowe, będące podstawowymi jednostkami strukturalnymi peptydów

i białek. W budowie białek wszystkich organizmów uczestniczy tylko 20 typowych aminokwasów. W ich cząsteczce

wyróżnia się centralnie położony atom węgla a , do którego kowalencyjnie przyłączone są: grupy aminowa i

karboksylowa (stąd nazywane są a -aminokwasami), atom wodoru oraz łańcuch boczny (R) (rys. 1). Łańcuchy

boczne determinują właściwości fizykochemiczne a -aminokwasów. Podział a -aminokwasów ze względu na

budowę ich łańcucha bocznego przedstawiono w tab. 1. Wszystkie a -aminokwasy są bezbarwne.

aminokwasy

hydrofobowe

alifatyczne

glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna,

metionina, cysteina i prolina

aromatyczne fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan

pozbawione ładunku asparagina, glutamina, seryna i treonina

aminokwasy

hydrofilowe

(polarne)

obdarzone

ładunkiem

zasadowe

lizyna, arginina i histydyna

kwasowe kwas asparaginowy i kwas glutaminowy

Tab. 1. Podział aminokwasów występujących w białkach ze względu na właściwości łańcucha bocznego.

W organizmach występują także dodatkowe a -aminokwasy, które nie uczestniczą w budowie białek, lecz

biorą udział w wyspecjalizowanych przemianach, np. ornityna i cytrulina w syntezie argininy ( a -aminokwasu

występującego w białkach) i w cyklu mocznikowym w wątrobie lub są hormonami, np. tyroksyna i trójjodotyronina

(hormony tarczycy). W organizmach spotyka się również aminokwasy o innej budowie cząsteczki niż a -

aminokwasy, np. neuroprzekaźnik GABA (kwas γ-aminomasłowy), który jest γ-aminokwasem (grupa aminowa

znajduje się przy trzecim atomie węgla, nie licząc atomu węgla z grupy karboksylowej).

Peptydy i białka

Aminokwasy mogą łączyć się liniowo między sobą wiązaniem peptydowym, które jest tworzone między grupą

a -karboksylową jednego aminokwasu a a -aminową kolejnego (rys. 1). Powstają wówczas bezbarwne peptydy.

H 2 N

C COOH

H 2 N

C COOH

H 2 N

C C

C COOH

H 2 O

R 1

R 2

R 1

H R 2

aminokwas 1

aminokwas 2

dwie reszty aminokwasowe połączone

wiązaniem peptydowym (dipeptyd)

Rys. 1. Schemat budowy α-aminokwasu oraz tworzenie wiązania peptydowego.

Cząsteczki zbudowane z mniej niż 25 reszt aminokwasowych określa się mianem oligopeptydów, a dłuższe,

zbudowane z 25 i więcej reszt aminokwasowych – polipeptydów. Przykładami oligopeptydów występujących w

naturze są niektóre hormony, np. oksytocyna lub wazopresyna. Są nimi także: przeciwutleniacz glutation oraz

niektóre antybiotyki, np. gramicydyna lub walinomycyna (nie są one jednak kodowane przez DNA, jak inne

Biochemia (wersja mała) / Podstawy biochemii dla ochrony środowiska

peptydy czy wszystkie białka, zaś te antybiotyki są peptydami cyklicznymi). Łańcuch polipeptydowy stanowi

podstawę budowy białka. Małe białka zawierają ok. 100 reszt aminokwasowych, średnie – kilkaset, zaś duże –

kilka tysięcy takich reszt. Pewne białka mogą być zbudowane z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego, np.

2, przy czym, dwa takie same łańcuchy tworzą homodimer, zaś dwa różniące się między sobą łańcuchy –

heterodimer. Dość często spotykane są także trimery (3 łańcuchy) i tetramery (4 łańcuchy). W cząsteczkach białek

mogą występować ugrupowania nie będące resztami aminokwasowymi (np. hem w hemoglobinie i cytochromach,

reszty fosforanowe, reszty cukrów) lub jony metali. Niektóre z tych ugrupowań mogą nadawać zawierającym je

białkom barwę, np. hem - barwę czerwoną. Masę cząsteczkową białek podaje się w daltonach (Da) [1 Da równy

jest 1 atomowej jednostce masy (u)]. Małe białka mają masę kilkunastu tysięcy Da (kDa), średnie – kilkudziesięciu

kDa, zaś duże – ponad 100 kDa. Kompleksy zbudowane z wielu białek mogą mieć masę milionów Da (MDa).

W wyniku fałdowania łańcucha polipeptydowego powstaje specyficzna konformacja (kształt) białka. Wyróżnia

się cztery poziomy struktury przestrzennej białek:

1. struktura pierwszorzędowa – sekwencja aminokwasowa; skład aminokwasowy determinuje właściwości

fizykochemiczne białka a także kolejne poziomy jego struktury,

2. struktura drugorzędowa – przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych znajdujących się blisko siebie w

łańcuchu polipeptydowym; do najczęściej występujących struktur drugorzędowych należą: a helisa,

struktura b i zwrot b,

3. struktura trzeciorzędowa – przestrzenne ułożenie całego łańcucha polipeptydowego, ułożenie względem

siebie poszczególnych struktur drugorzędowych,

4. struktura czwartorzędowa – dotyczy białek zbudowanych z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego i

oznacza ułożenie względem siebie tych podjednostek i rodzaj oddziaływań między nimi.

Struktura białek utrzymywana jest przy udziale wiązań kowalencyjnych, jonowych, hydrofobowych,

wodorowych i sił van der Waalsa.

Generalna tendencja rządząca fałdowaniem białek to dążenie do ukrycia reszt aminokwasów hydrofobowych

wewnątrz cząsteczki, a eksponowanie reszt aminokwasów polarnych na jego powierzchni w przypadku białek

funkcjonujących w środowisku hydrofilowym (np. w cytozolu). Białka występujące w środowisku hydrofobowym

(np. w błonie komórkowej) wykazują tendencję odwrotną.

Obecnie w badaniach białek można wyróżnić dwa podejścia:

podejście klasyczne polegające na izolacji pojedynczego białka i jego dalszej analizie,

podejście proteomiczne polegające na badaniu wzajemnych zależności białek, ich współoddziaływania.

Opiera się ono nie na izolacji poszczególnych białek, ale na analizie całych kompleksów wielobiałkowych

lub nawet całego komponentu białkowego organelli lub komórki (proteomu).

Izolacja i oczyszczanie białek

Cel, w jakim ma być wykorzystane białko, determinuje dobór materiału biologicznego, z którego jest ono

izolowane oraz metody jego oczyszczania. Zależą one od tego, czy otrzymywane białko powinno zachować swoją

formę natywną i aktywność biologiczną, np. przy badaniach enzymatycznych, czy powinno zostać oczyszczone do

pełnej jednorodności (homogenności), np. przy badaniach strukturalnych lub czy ma być zastosowane jako lek.

Najkorzystniejszym źródłem białka będzie materiał zawierający jak najwięcej izolowanego białka dającego się

łatwo otrzymać w roztworze w formie stabilnej, a jednocześnie ubogi w zanieczyszczenia i możliwie najtańszy.

Obecnie coraz częściej w celu uzyskania potrzebnych białek przeprowadza się ich produkcję w komórkach

bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach komórek ssaczych. Otrzymane w ten sposób białka nazywane są

białkami rekombinowanymi . Zaletą takiego podejścia jest możliwość otrzymania dużej ilości potrzebnego białka,

a jego oczyszczanie do homogenności jest stosunkowo proste.

Dla każdego białka powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania, wykorzystujący jego

własności fizykochemiczne i biologiczne. Oczyszczanie białka można podzielić na kilka etapów:

1. wyodrębnianie z materiału biologicznego

· rozdrobnienie materiału, rozbicie tkanek i komórek (homogenizacja, rozbicie ultradźwiękami),

· ekstrakcja białka do roztworu wodnego i usunięcie pozostałego materiału poprzez odwirowanie lub

przesączenie,

2. wstępne oczyszczanie (opcjonalne)

wytrącenie białka z roztworu w wyniku frakcjonowania wzrastającymi ilościami rozpuszczalników lub

wysolenie siarczanem amonu i usunięcie czynnika wytrącającego białko przy pomocy dializy,

Biochemia (wersja mała) / Podstawy biochemii dla ochrony środowiska

3. oczyszczanie

· chromatografia (patrz niżej),

4. zmiana warunków jonowych (opcjonalne)

· dializa (patrz niżej),

5. analiza czystości preparatu

· elektroforeza (patrz niżej).

Najczęściej izolację białek przeprowadza się w niskiej temperaturze (2 - 4 o C) i w obecności inhibitorów proteaz

(enzymów degradujących białka).

Chromatografia jest to szeroki zakres metod używanych do rozdzielania i/lub analizowania złożonych

mieszanin związków różniących się właściwościami fizykochemicznymi (ładunkiem, wielkością, kształtem,

rozpuszczalnością), a także właściwościami biologicznymi. Metodami chromatograficznymi można rozdzielać

aminokwasy, peptydy, białka, ale także nukleotydy, kwasy nukleinowe, lipidy i cukry.

Cząsteczki podlegające rozdziałowi chromatograficznemu rozmieszczają się pomiędzy dwie fazy: fazę

stacjonarną i fazę ruchomą, która przepływa przez fazę stacjonarną. W zależności od rodzaju fazy stacjonarnej

rozróżniamy chromatografię bibułową, cienkowarstwową, gazową i cieczową.

Białka rozdzielamy metodą chromatografii cieczowej, gdzie fazę stacjonarną stanowi złoże hydrofilowe, które

mogą stanowić nierozpuszczalne związki agarozy, dekstranu lub polimerów akryloamidu.

Przy oczyszczaniu białek najczęściej wykorzystujemy chromatografię kolumnową. Kolumna to rurka szklana,

plastikowa lub metalowa wypełniona złożem (faza stacjonarna) zrównoważonym buforem o odpowiednim składzie

jonowym i pH. Mieszaninę rozdzielanych białek wprowadzamy na kolumnę w buforze fazy ruchomej. Im większe

powinowactwo białka do fazy stacjonarnej tym wolniej przesuwa się na kolumnie. Białka są eluowane

(wymywane) z kolumny kolejnymi porcjami buforu w zależności od ich powinowactwa do złoża – najsłabiej

zaadsorbowane pojawią się w eluacie jako pierwsze, najsilniej – jako ostatnie.

Różne typy chromatografii cieczowej wykorzystują różne własności białek (tab. 2). Aby otrzymać wysoce

oczyszczone białko na ogół trzeba zastosować procedurę składającą się z kilku rozdziałów chromatograficznych.

Cecha białka

Technika chromatograficzna

wielkość i/lub kształt

filtracja żelowa (sączenie molekularne)

ładunek

chromatografia jonowymienna

hydrofobowość

chromatografia hydrofobowa

specyficzność biologiczna

chromatografia powinowactwa

Tab. 2. Wybrane typy chromatografii białek.

Techniki chromatograficzne różnią się złożami fazy stacjonarnej. W ramach tego ćwiczenia wykonana zostanie

chromatografia kolumnowa na przykładzie filtracji żelowej . Do filtracji żelowej wykorzystuje się obojętne

chemicznie, hydrofilowe, usieciowane złoże, uformowane w ziarna z porami o ściśle określonych wymiarach.

Cząsteczki większe niż pory nie mogą do nich wniknąć i przemieszczają się w kolumnie szybciej niż małe

cząsteczki, które zajmują przestrzeń wewnątrz i na zewnątrz ziaren. Zatem, w wycieku z kolumny jako pierwsze

pojawią się większe cząsteczki (rys. 2). W zależności od stopnia usieciowania złoża można rozdzielać białka o

różnej wielkości. Filtrację żelową można stosować także do usuwania substancji drobnocząsteczkowych z

preparatów izolowanego białka oraz do wyznaczania masy nienaruszonych kompleksów wielobiałkowych.

Inną metodą pozwalającą na usunięcie z wodnego roztworu związków drobnocząsteczkowych (takich jak np.

sole, rozpuszczalniki organiczne, aminokwasy, nukleotydy oraz cukry proste) jest dializa . Polega ona na

przechodzeniu przez półprzepuszczalną błonę (np. celulozową błonę woreczka dializacyjnego) cząsteczek

mniejszych niż pory w tej błonie, do roztworu na zewnątrz woreczka, a zatrzymywaniu w roztworze w woreczku

cząsteczek zbyt dużych, aby mogły przejść przez te pory (substancji wielkocząsteczkowych, np. białek lub kwasów

nukleinowych). Przechodzenie przez błonę trwa do momentu wyrównania stężenia danego związku

drobnocząsteczkowego po obu stronach błony i można je przyspieszyć poprzez stałe mieszanie oraz wymianę

roztworu na zewnątrz woreczka.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: