Hodowla i identyfikacja bakterii.doc

Hodowla i identyfikacja bakterii

Metody diagnostyki mikrobiologicznej

n                   Metody mikroskopowe

n                   Metody hodowlane

n                   Metody immunologiczne

n                   Metody biochemiczne

n                   Metody oparte na biologii molekularnej

n                   Ocena lekowrażliwości

I.                   Preparaty mikroskopowe

II.              Metody hodowlane

Pożywki bakteryjne

n                    Obecnie na rynku dostępne są gotowe podłoża i składniki do pożywek, w formie odwodnionej lub proszku o wystandaryzowanym składzie:

n                    zapewnienie powtarzalności warunków hodowli,

n                    porównywanie wyników doświadczeń prowadzonych w różnym czasie lub różnych laboratoriach.

n                    skrócenie czasu przygotowania do doświadczeń.

Podłoże mikrobiologiczne powinno:

n                    zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno organicznych, jak i nieorganicznych (energetycznych i budulcowych),

n                    zawierać określone czynniki wzrostowe,

n                    mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,

n                    zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do tlenu,

n                    wykazywać właściwą temperaturę i pH.

Podział podłoży

n                    Ze względu na konsystencję

n Płynne (bulion mięsny, bulion mózgowo-sercowy)

n Półpłynne (0,5-1% agaru)

n Stałe (1,5-3% agaru)

n                    Ze względu na zawartość substancji

n Syntetyczne (skład chemiczny całkowicie zdefiniowany)

n Półsyntetyczne (skład chemiczny częściowo zdefiniowany)

n Naturalne ( skład chemiczny zdefiniowany w przybliżeniu)

n                    Ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

n Proste (podstawowe) – przeznaczone dla drobnoustrojów o niskich wymaganiach odżywczych, np. Bulion zwykły (płynne), Woda peptonowa (płynne), Agar zwykły (stałe), Żelatyna (stałe).

n Złożone (wzbogacone):

n             Rosną na nich bakterie wymagające, 

n             Składają się z pożywki prostej i składnika wzbogacającego , np. krew zwierzęca, żółtka kurzego.

n             Przykłady: agar z krwią (stałe), podłoże Müller-Hinton (stałe; do antybiogramów- hydrolizat kazeiny).

                            Agar z krwią:

n                   Pozwala na różnicowanie gatunków i rodzajów – typ hemolizy:

n       α – częściowa

n       β – całkowita

n       γ – brak hemolizy

                            Müeller-Hinton - podłoże do oceny lekowrażliwości

n Podłoża wybiórczo – namnażające

n             Przeznaczone dla określonych drobnoustrojów.

n             Zawierają podłoża proste lub wzbogacone, do których dodano substancje przyspieszających wzrost określonych mikroorganizmów i hamujące lub uniemożliwiające wzrost innych.

n             Przykład: bulion z żółcią, podłoże SS

n Podłoża wybiórczo – różnicujące

n             Są przeznaczone dla wybranych bakterii, które są różnicowane na drodze właściwości biochemicznych

                            Podłoże Chapmana dla gronkowców :

n                   czynnik wybiórczy: 7,5% NaCl (hamuje wzrost większości drobnoustrojów

n                   czynnik różnicujący: mannitol

n                   Staphylococcus aureus fermentuje mannitol zakwaszając środowisko – duże kolonie otoczone żółtą strefą;

n                   Staphylococcus epidermidis – mannitolo (-) - małe kolonie bez żółtego zabarwienia)

                            Podłoże MacConkey’a (MCA) – dla pałeczek Gram – ujemnych z rodziny                                           Enterobacteriaceae

n                   czynniki wybiórcze: dezoksycholan sodu i fiolet krystaliczny – hamują wzrost bakterii Gram (+)

n                  czynnik różnicujący – laktoza

n                   bakterie rozkładające laktozę (E. coli) tworzą różowo zabarwione kolonie

n                   bakterie nierozkładające laktozy (Proteus vulgaris) – kolonie przezroczyste

n                   Pałeczki rozkładające dezoksycholan sodu dają wokół kolonii strefę wytrąconego kwasu dezoksycholowego.

Podłoże Saburaud’a –wybiórcze dla grzybów (obniżone pH, zawiera antybiotyki: cykloheksamid i chloramfenikol)

§ Podłoża specjalne - hodowla drobnoustrojów „wybrednych”, o specjalnych wymaganiach wzrostowych

Agar czekoladowy – zawiera zhemolizowaną krew (otrzymuje się przez zagotowanie agaru z krwią, proces ten uwalnia czynniki wzrostowe z krwinek) rosną na nim Haemophillus spp., Neisseria spp.

n Podłoża transportowe – umożliwiają przeżycie bakterii w czasie transportu.

n Podłoża transportowo – namnażające. Ich skład chemiczny umożliwia namnażanie się bakterii w czasie transportu.

Metody wykonania posiewu na podłoża stałe

Posiew redukcyjny – proces posiewania podzielić można na cztery części.

Po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną w płomieniu palnika ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości szalki Petriego (etap 1).

Następnie sterylizujemy użytą ezę, dla wygody obracamy płytkę o 90° i powtarzamy czynność (etap 2).

Obracamy znów płytkę Petriego (trzymając się obranego kierunku) i powtarzamy czynności (etap 3).

W etapie 4 ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku. W tym momencie posiew został zakończony, płytkę możemy włożyć do cieplarki.

III.              Metody immunologiczne

n                    Techniki diagnostyczne oparte są na reakcjach immunologicznych antygen (Ag) - przeciwciało (Ig) i stosowane w diagnostyce chorób zakaźnych do wykrywania jakościowo i/lub ilościowo antygenów (identyfikacja drobnoustrojów), bądź przeciwciał w surowicy, płynach ustrojowych, tkankach;

n                    Reakcje Ag - Ig zależą m.in. od: powinowactwa (affinity) i zachłanności (avidity) Ig do Ag, od obecności innych czynników (dopełniacz), stężenia reagentów, temp. itd.

Podział metod immunologicznych

n                    Odczyny, w których zachodzi bezpośrednie łączenie się antygenu z przeciwciałem: immunofluorescencja, odczyny radioimmunologiczne i immunoenzymatyczne bezpośrednie.

n                    Odczyny, w których zachodzą różne reakcje fizykochemiczne (aglutynacja bezpośrednia, aglutynacja pośrednia, koaglutynacja, immunoprecypitacja) lub w których uczestniczą dodatkowe elementy (np. nośniki, dopełniacz).

n                    Interakcje trzeciorzędowe – wykorzystujące pewne efekty biologiczne np. fagocytoza – opsonizacja, chemotaksja, immunoadherencja.

ODCZYNY AGLUTYNACYJNE

n                    Aglutynacja – immunochemiczna, swoista agregacja cząstek (bakterie, grzyby, erytrocyty, syntetyczne koloidy) opłaszczonych antygenami lub przeciwciałami.

              Aglutynogeny ( Ag) + aglutyniny (Ig) =  aglutynant

n                    Zastosowanie odczynów bezpośrednich:

n odczyn Widala - w diagnostyce duru brzusznego (S. typhi) i durów rzekomych (S. paratyphi A, B lub C),

n odczyn Weil-Felixa - w diagnostyce duru plamistego i innych riketsjoz (zjawisko paraaglutynacji),

n odczyn Weigla - w diagnostyce duru plamistego,

n odczyn Wrighta - w diagnostyce brucelozy (Brucella spp.).

n                    Zastosowanie odczynów pośrednich:

n do wykrywania obecności czynnika reumatoidalnego (RF) w RZS

n do wykrywania antystreptolizyny O w zakażeniach paciorkowcowych,

...