Temat ćwiczeń:
Analiza restrykcyjna bakteriofaga ƛ
Cel ćwiczeń:
Metoda lizy alkalicznej służy do izolacji - oczyszczania DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych.
Zasada metody:
Metody oczyszczania plazmidowego DNA obejmują 3 główne etapy:
· hodowla bakterii (i ewentualnie amplifikacja[namnażanie] plazmidu)
· liza bakterii
· oczyszczanie plazmidowego DNA
Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim
antybiotykiem. Do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego. We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA
wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:
· DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu
· podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. Covalently closed circle)
Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie[rozpad obłonionych elementów (zwykle komórek) poprzez dezintegrację błony i wylanie się zawartości do środowiska]. Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Podczas rozpadu komórek bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki bakteryjnej jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek. Usunięcie kwasu RNA przeprowadza się enzymem z klasy hydrolaz, inkubując próbki z RNazą, co spowoduje hydrolizę wiązania fosfodiestrowego i zniszczenie RNA w komórce. W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu. Z odbiałczanych próbek DNA wytracany jest alkoholem etylowym w obecności octanu amonowego.
Wyniki:
Forma jednoniciowa kolista
Forma liniowa
Forma CCC pożądana - Grupa 3
Izolacja się powiodła - na żelu widoczne formy CCC (pożądane) oraz OC i L (niepożądane) plazmidu
Wnioski
Pierwszym krokiem w analizie sekwencji sklonowanego odcinka DNA jest ustalenie, jak uszeregowane są na nim miejsca cięcia enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne, o czym była mowa wcześniej, przecinają duże cząsteczki DNA, dając powtarzalne zbiory stosunkowo niewielkich fragmentów DNA. Fragmenty te można rozdzielić ze względu na ich wielkość dzięki elektroforezie w półpłynnym żelu. Ogólnie rzecz biorąc, im krótszy jest taki dwuniciowy odcinek, tym szybciej porusza się on w polu elektrycznym. Stosując różne rodzaje elektroforezy, można rozdzielać fragmenty liczące od dwudziestu do milionów par zasad. Używając wzorców, czyli odcinków o znanej wielkości, można łatwo określić wielkość badanego fragmentu posługując się linijką i prostym wykresem. Do przeprowadzenia analizy wystarcza zwykle mniej niż mikrogram (milionowa część grama) DNA, ponieważ odcinki DNA można łatwo wykryć po wybarwieniu ich odpowiednim barwnikiem. Zestaw fragmentów powstających w wyniku działania określonej restryktazy stanowi swoisty„odcisk palca” wyjściowego DNA. Analizując fragmenty powstałe w wyniku działania różnych enzymów restrykcyjnych oraz ich rozmaitych kombinacji, można często ustalić kolejność występowania badanych fragmentów w wyjściowej cząsteczce DNA. W rezultacie otrzymujemy fizyczną mapę DNA, która, jeśli jest wystarczająco szczegółowa, jednoznacznie opisuje oryginalną cząsteczkę DNA. Zrekombinowane wektory są zwykle niewielkie, skonstruowanie ich mapy fizycznej nie przedstawia więc dużych trudności. Jednak trawienie enzymami restrykcyjnymi dużych cząsteczek DNA daje złożone zestawy fragmentów. Bardzo użyteczne do sporządzania map takich cząsteczek, na podstawie analizy zestawów ich fragmentów, są specjalne programy komputerowe.
Procedura ta, znana pod angielską nazwą blotting DNA1 jest szeroko stosowana; służy ona nie tylko do charakteryzowania sklonowanych DNA. Jednym z najważniejszych zastosowań tej metody jest odnajdywanie wśród wielu, wielu innych, tego fragmentu DNA, w którym występuje poszukiwany gen. Mieszanina fragmentów uzyskana po potraktowaniu całkowitego komórkowego DNA enzymem restrykcyjnym może być elektroforetycznie rozdzielona. Jeśli genom jest bardzo duży, tak jak genom ludzki (sześć miliardów par zasad), powstają miliony fragmentów o różnych wielkościach. Po wybarwieniu żelu barwnikiem odróżnienie poszczególnych fragmentów DNA jest niemożliwe – wszystkie one razem bowiem tworzą jedną smugę DNA. Dzieje się tak dlatego, że żaden z fragmentów (spośród milionów, które powstają) nie występuje w wystarczająco dużej ilości, by stał się widoczny jako oddzielny prążek. Lecz jeśli taki żel zostanie przeniesiony na arkusz nitrocelulozowy i zwiąże się z radioaktywną sondą DNA lub RNA, odpowiadający jej komplementarny fragment genomowego DNA ujawni się jako radioaktywny pojedynczy prążek w miejscu właściwym dla swojej wielkości. Wystarczy kilka milionowych części grama całkowitego genomowego DNA. Technika ta – hybrydyzacja genomowa (blotting genomowy) odgrywa bardzo ważną rolę wśród nowoczesnych metod tworzenia map genetycznych. Jest również podstawową techniką diagnozowania wielu chorób genetycznych i wirusowych; stosuje się ją także w medycynie sądowej do identyfikacji zarówno ofiar, jak i sprawców przestępstwa. W dalszych rozdziałach będziemy odwoływali się do różnych metod umożliwiających wykrywanie i identyfikację RNA i białek.
DagaD91