BiologiaIVRec.pdf

(1708 KB) Pobierz
Microsoft PowerPoint - BiologiaIVRec.ppt
Receptory(c.d.)
GabrielNowak,MałgorzataDybała
ZakładCytobiologiiiHistochemii,
Pracownia
Pracownia Farmakobiologii
Farmakobiologii
Collegium Medicum
Uniwersytet
Jagielloński
Jagielloński
Zagadnienia:
Izotopy nuklidy(jądraatomowe)otejsamejliczbie
atomowejiróŜnejliczbiemasowej,tj.ojednakowej
liczbieprotonówiróŜnejliczbieneutronównp.:
”?
Działanielekównazasadzieinterakcji
Radioligand binding
binding assay
assay ”?
12 C, 14 C;
1 H(wodórzwykły), 2 H(deuter), 3 H(tryt)
Działanielekównazasadzieinterakcji
ligand
receptor
Podstawowewłaściwościwiązanialigand
Podstawowewłaściwościwiązanialigand
receptor
Izotoppromieniotwórczy,radioizotop – izotopdanego
pierwiastka,któregojądrawykazujązdolnośćsamorzutnej
przemianyzemisjąpromieniowaniajonizującego.
receptor
jestefektemniestabilnegoukładu
protonówineutronówwjądrze,któreulegasamorzutnemurozpadowi
wceluosiągnięcianiŜszego(bardziejkorzystnego)stanuenergetycznego.
Takistanjestosiąganyprzezemisjęcząstekalfalubbeta.
Radioligand binding
binding assays
assays
tojądraatomuhelu,składającesięzdwóchprotonówidwóch
neutronów.
A X→ A4 X+ 4 He
Z
Ligandznakowanyradioizotopem
Z22
toelektronyemitowanezjąder(neutron→ elektron+proton+v )
A X→ A X+β +v
Z
Z+1
3 H, 125 I,...
tofaleelektromagnetyczne,któretowarzyszyemisji
cząstekalfalubbeta
1
ZakładCytobiologiiiHistochemii,
Collegium
Medicum Uniwersytet
Coznaczy„
Coznaczy„ Radioligand
ligand– receptor
Radioligand
707302979.548.png 707302979.657.png 707302979.742.png 707302979.753.png 707302979.001.png 707302979.012.png
 
707302979.033.png 707302979.044.png 707302979.055.png 707302979.066.png 707302979.077.png 707302979.088.png 707302979.099.png 707302979.110.png 707302979.121.png 707302979.132.png 707302979.143.png 707302979.154.png 707302979.165.png 707302979.176.png 707302979.187.png 707302979.198.png 707302979.209.png 707302979.220.png 707302979.231.png 707302979.242.png 707302979.253.png 707302979.264.png 707302979.275.png 707302979.286.png 707302979.297.png 707302979.308.png 707302979.319.png 707302979.330.png 707302979.341.png 707302979.351.png 707302979.362.png 707302979.373.png 707302979.384.png 707302979.395.png 707302979.406.png 707302979.417.png 707302979.428.png 707302979.439.png 707302979.450.png 707302979.461.png 707302979.471.png 707302979.482.png 707302979.493.png 707302979.504.png 707302979.515.png 707302979.526.png 707302979.537.png 707302979.549.png 707302979.559.png 707302979.570.png 707302979.581.png 707302979.592.png 707302979.603.png 707302979.614.png 707302979.625.png 707302979.636.png 707302979.647.png 707302979.658.png 707302979.669.png 707302979.680.png 707302979.691.png 707302979.702.png 707302979.713.png 707302979.724.png 707302979.735.png 707302979.740.png 707302979.741.png 707302979.743.png 707302979.744.png 707302979.745.png 707302979.746.png 707302979.747.png 707302979.748.png 707302979.749.png 707302979.750.png 707302979.751.png 707302979.752.png 707302979.754.png 707302979.755.png 707302979.756.png 707302979.757.png 707302979.758.png 707302979.759.png 707302979.760.png 707302979.761.png 707302979.762.png 707302979.763.png 707302979.002.png 707302979.003.png 707302979.004.png 707302979.005.png 707302979.006.png 707302979.007.png 707302979.008.png 707302979.009.png 707302979.010.png 707302979.011.png 707302979.013.png 707302979.014.png 707302979.015.png 707302979.016.png 707302979.017.png 707302979.018.png 707302979.019.png 707302979.020.png 707302979.021.png 707302979.022.png 707302979.023.png 707302979.024.png 707302979.025.png 707302979.026.png 707302979.027.png 707302979.028.png 707302979.029.png 707302979.030.png 707302979.031.png 707302979.032.png 707302979.034.png 707302979.035.png 707302979.036.png 707302979.037.png 707302979.038.png 707302979.039.png 707302979.040.png 707302979.041.png 707302979.042.png 707302979.043.png 707302979.045.png 707302979.046.png 707302979.047.png 707302979.048.png 707302979.049.png 707302979.050.png 707302979.051.png 707302979.052.png 707302979.053.png 707302979.054.png 707302979.056.png 707302979.057.png 707302979.058.png 707302979.059.png 707302979.060.png 707302979.061.png 707302979.062.png 707302979.063.png 707302979.064.png 707302979.065.png 707302979.067.png 707302979.068.png 707302979.069.png 707302979.070.png 707302979.071.png 707302979.072.png 707302979.073.png 707302979.074.png 707302979.075.png 707302979.076.png 707302979.078.png 707302979.079.png 707302979.080.png 707302979.081.png 707302979.082.png 707302979.083.png 707302979.084.png 707302979.085.png 707302979.086.png 707302979.087.png 707302979.089.png 707302979.090.png 707302979.091.png 707302979.092.png 707302979.093.png 707302979.094.png 707302979.095.png 707302979.096.png 707302979.097.png 707302979.098.png 707302979.100.png 707302979.101.png 707302979.102.png 707302979.103.png 707302979.104.png 707302979.105.png 707302979.106.png 707302979.107.png 707302979.108.png 707302979.109.png 707302979.111.png 707302979.112.png 707302979.113.png 707302979.114.png 707302979.115.png 707302979.116.png 707302979.117.png 707302979.118.png 707302979.119.png 707302979.120.png 707302979.122.png 707302979.123.png 707302979.124.png 707302979.125.png 707302979.126.png 707302979.127.png 707302979.128.png 707302979.129.png 707302979.130.png 707302979.131.png 707302979.133.png 707302979.134.png 707302979.135.png 707302979.136.png 707302979.137.png 707302979.138.png 707302979.139.png 707302979.140.png 707302979.141.png 707302979.142.png 707302979.144.png 707302979.145.png 707302979.146.png 707302979.147.png 707302979.148.png 707302979.149.png 707302979.150.png 707302979.151.png 707302979.152.png 707302979.153.png 707302979.155.png 707302979.156.png 707302979.157.png 707302979.158.png 707302979.159.png 707302979.160.png 707302979.161.png 707302979.162.png 707302979.163.png 707302979.164.png 707302979.166.png 707302979.167.png 707302979.168.png 707302979.169.png 707302979.170.png 707302979.171.png 707302979.172.png 707302979.173.png 707302979.174.png 707302979.175.png 707302979.177.png 707302979.178.png 707302979.179.png 707302979.180.png 707302979.181.png 707302979.182.png 707302979.183.png 707302979.184.png 707302979.185.png 707302979.186.png 707302979.188.png 707302979.189.png 707302979.190.png 707302979.191.png 707302979.192.png 707302979.193.png 707302979.194.png 707302979.195.png 707302979.196.png 707302979.197.png 707302979.199.png 707302979.200.png 707302979.201.png 707302979.202.png 707302979.203.png 707302979.204.png 707302979.205.png 707302979.206.png 707302979.207.png 707302979.208.png 707302979.210.png 707302979.211.png 707302979.212.png 707302979.213.png 707302979.214.png 707302979.215.png 707302979.216.png 707302979.217.png 707302979.218.png 707302979.219.png 707302979.221.png 707302979.222.png 707302979.223.png 707302979.224.png 707302979.225.png 707302979.226.png 707302979.227.png 707302979.228.png 707302979.229.png 707302979.230.png 707302979.232.png 707302979.233.png 707302979.234.png 707302979.235.png 707302979.236.png 707302979.237.png 707302979.238.png 707302979.239.png 707302979.240.png 707302979.241.png 707302979.243.png 707302979.244.png 707302979.245.png 707302979.246.png 707302979.247.png 707302979.248.png 707302979.249.png 707302979.250.png 707302979.251.png 707302979.252.png 707302979.254.png 707302979.255.png 707302979.256.png 707302979.257.png 707302979.258.png 707302979.259.png 707302979.260.png 707302979.261.png 707302979.262.png 707302979.263.png 707302979.265.png 707302979.266.png 707302979.267.png 707302979.268.png 707302979.269.png 707302979.270.png 707302979.271.png 707302979.272.png 707302979.273.png 707302979.274.png 707302979.276.png 707302979.277.png 707302979.278.png 707302979.279.png 707302979.280.png 707302979.281.png 707302979.282.png 707302979.283.png 707302979.284.png 707302979.285.png 707302979.287.png 707302979.288.png 707302979.289.png 707302979.290.png 707302979.291.png 707302979.292.png 707302979.293.png 707302979.294.png 707302979.295.png 707302979.296.png 707302979.298.png 707302979.299.png 707302979.300.png 707302979.301.png 707302979.302.png 707302979.303.png 707302979.304.png 707302979.305.png 707302979.306.png 707302979.307.png 707302979.309.png 707302979.310.png 707302979.311.png 707302979.312.png 707302979.313.png 707302979.314.png 707302979.315.png 707302979.316.png 707302979.317.png 707302979.318.png 707302979.320.png 707302979.321.png 707302979.322.png 707302979.323.png 707302979.324.png 707302979.325.png 707302979.326.png 707302979.327.png 707302979.328.png 707302979.329.png 707302979.331.png 707302979.332.png 707302979.333.png 707302979.334.png 707302979.335.png 707302979.336.png 707302979.337.png 707302979.338.png 707302979.339.png 707302979.340.png 707302979.342.png 707302979.343.png 707302979.344.png 707302979.345.png
Radioligand binding
binding assays
assays
Receptorymetabotropowe
SązwiązanezsystememwtórnychprzekaźnikówzapośrednictwemGTP.
Przyłączenieendogennegoliganda(agonisty)domiejscawiązaniainicjuje
kaskadęsygnałówwewnątrzkomórkowych(np.przezfosforylację)
Wiązanieligandadokomponentybiałkowej
  Neurotransmitery
  Hormony
  Czynnikiwzrostu
  Cytokiny
  Leki
  Toksyny
  ..........
Efektor
  Receptory
  Kanałyjonowe(VS)
  Enzymy
  Cząstkitransportujące
(VS)=Voltage sensitive
BiałkoG
Receptoryjonotropowe =kanałyjonowebramkowaneligndem
Podstawydziałanialeków:interakcjaligand receptor
Wtymprzypadkuefektor
(bramka)jestczęścią
receptora !
Przyłączenie
neurotransmitera
Wielelekówmusiwiązaćsięzreceptoremabywywołaćefekt.
Takielekisą ligandami.
Bramkowanieligandem oznacza,Ŝe
dootwarciakanałukoniecznejest
przyłączeniespecyficznegotransmitera
(agonisty)dozewnątrzkomórkowejczęści
receptora.
Otwarcie
kanału
Jeśliefektemwiązanialigandadomiejscawiązania
sązmiany konformacyjneiodpowiedźkomórkowa
totakiligandjest agonistą.
Zajęciemiejscarozpoznaniaprzez
endogennyligand(agonistę)prowadzido
napływujonówprzezbłonękomórkową.
Wpływjonów
przezbłonę
PrzyłączenieligandadomiejscawiązaniamoŜeniepowodować
odpowiedzikomórkowej.Jakkolwiek,zajęcietegomiejscaczynije
niezdolnymdoprzyłączaniainnychligandów,m.in.endogennych
agonistów.Wtymprzypadkuligandnazywamy antagonistą.
Matematycznemodelowanieodwracalnegowiązanialiganda
!
Wiązanieligandadomiejscawiązanianareceptorze
niezawszepociągazasobąodpowiedź
wewnątrzkomórkową.
KaŜdacząstkaliganda(L)moŜetworzyćzreceptorem(R)
kompleksligand– receptor(LR)
!
Wiązanieligandadoreceptorajesttylkojednym
aspekteminterakcjiligand– receptor.
[L]+[R]
[LR]
Radioligand binding assay dostarczainformacjitylkoo
powinowactwieligandadomiejscawiązania.
Tenkompleks(LR)moŜewkaŜdymmomencieulecrozpadowi,wwynikuczego
powstajewolnacząstkaliganda(L)iniezwiązanyreceptor(R).
Wniosek: wcelusprawdzenia,czyligandjestagonistą,czyantagonistą
koniecznejestprzeprowadzenietestówfunkcjonalnych.
2
Radioligand
707302979.346.png 707302979.347.png 707302979.348.png 707302979.349.png 707302979.350.png
 
707302979.352.png 707302979.353.png 707302979.354.png 707302979.355.png 707302979.356.png 707302979.357.png 707302979.358.png 707302979.359.png 707302979.360.png 707302979.361.png 707302979.363.png 707302979.364.png 707302979.365.png 707302979.366.png 707302979.367.png 707302979.368.png 707302979.369.png 707302979.370.png 707302979.371.png 707302979.372.png 707302979.374.png 707302979.375.png 707302979.376.png 707302979.377.png 707302979.378.png 707302979.379.png 707302979.380.png 707302979.381.png 707302979.382.png 707302979.383.png 707302979.385.png 707302979.386.png 707302979.387.png 707302979.388.png 707302979.389.png 707302979.390.png 707302979.391.png 707302979.392.png 707302979.393.png 707302979.394.png 707302979.396.png 707302979.397.png 707302979.398.png 707302979.399.png 707302979.400.png 707302979.401.png 707302979.402.png 707302979.403.png 707302979.404.png 707302979.405.png 707302979.407.png 707302979.408.png 707302979.409.png 707302979.410.png 707302979.411.png 707302979.412.png 707302979.413.png 707302979.414.png 707302979.415.png 707302979.416.png 707302979.418.png 707302979.419.png 707302979.420.png 707302979.421.png 707302979.422.png 707302979.423.png 707302979.424.png 707302979.425.png 707302979.426.png 707302979.427.png 707302979.429.png 707302979.430.png 707302979.431.png 707302979.432.png 707302979.433.png 707302979.434.png 707302979.435.png 707302979.436.png 707302979.437.png 707302979.438.png 707302979.440.png 707302979.441.png 707302979.442.png 707302979.443.png 707302979.444.png 707302979.445.png 707302979.446.png 707302979.447.png 707302979.448.png 707302979.449.png 707302979.451.png 707302979.452.png 707302979.453.png 707302979.454.png 707302979.455.png 707302979.456.png
Reakcjawiązanialiganda(L)zreceptorem(R)przebiegazgodnie
zprawemdziałaniamas(Guldberga iWaagego)
Dlaczego?
K D [LR]=[L][R]
jeststałe
gdzieK D jeststałądysocjacji.
K D zaleŜyodczynnikówfizycznychjaktemperaturaiod
chemicznychwłaściwościsubstancji.
Zaczekaj!
TosamorównaniemoŜebyćstosowanedlabardziejskomplikowanych modeli,
wktórychRiLRmogąmiećwielorakiekonformacje.
Pomyśl!
PoniewaŜcałkowitaliczbareceptorów
(wpreparacie)jestograniczona
Jeśliwiązanieliganda(klucza)do
komponentybiałkowej(receptora)wymaga
odpowiedniegodopasowaniapomiędzy
strukturąligandaamiejscem
wiązania(zamkiem)totakainterakcjajest
specyficzna.
Więcjakiejestwiązanie(binding)dotejograniczonejliczbyreceptorów?
wysycalne
Wiązaniedoreceptorówjest
STEREOSPECYFICZNE
Wiązaniedoreceptorówjestwysycalne (saturable)
Miejscewiązania
Jeślireceptorysąobecnewograniczonejilości,toprzypewnymstęŜeniu
ligandawszystkiereceptorysązwiązaneikrzywawiązaniaosiąga plateau.
Wiązanieligandadoreceptorajestspecyficzneiwysycalne
Wiązaniecałkowite
dladwóchligandów
AiB
Wiązanie jako%
maksymalnego
wiązaniaspecyficznego
Wracającdomodelowaniamatematycznego:
[L]+[R][LR]
Bmax
.....................................................................
...................................................................
.....................................................................
Wiązaniemaksymalne
JednacząstkaligandawiąŜesięzjednymreceptorem(miejscemwiąŜącym
ligand)wsposóbodwracalny zokreślonymiszybkościamiwiązania
(asocjacji)irozpadu(dysocjacji).Reakcjawiązanialiganda(L) zreceptorem(R)
przebiegazgodniezprawemdziałaniamas.
K D
.............................
K D [LR]=[L][R]
gdzieK D jeststałądysocjacji
...
............ [nM] ...................
3
707302979.457.png 707302979.458.png 707302979.459.png 707302979.460.png 707302979.462.png
 
707302979.463.png 707302979.464.png 707302979.465.png 707302979.466.png 707302979.467.png 707302979.468.png 707302979.469.png 707302979.470.png 707302979.472.png 707302979.473.png 707302979.474.png 707302979.475.png 707302979.476.png 707302979.477.png 707302979.478.png 707302979.479.png 707302979.480.png 707302979.481.png 707302979.483.png 707302979.484.png 707302979.485.png 707302979.486.png 707302979.487.png 707302979.488.png 707302979.489.png 707302979.490.png 707302979.491.png 707302979.492.png 707302979.494.png 707302979.495.png 707302979.496.png 707302979.497.png 707302979.498.png 707302979.499.png 707302979.500.png 707302979.501.png 707302979.502.png 707302979.503.png 707302979.505.png 707302979.506.png 707302979.507.png 707302979.508.png 707302979.509.png 707302979.510.png 707302979.511.png 707302979.512.png 707302979.513.png 707302979.514.png 707302979.516.png 707302979.517.png 707302979.518.png 707302979.519.png 707302979.520.png 707302979.521.png 707302979.522.png 707302979.523.png 707302979.524.png 707302979.525.png 707302979.527.png 707302979.528.png 707302979.529.png 707302979.530.png 707302979.531.png 707302979.532.png 707302979.533.png 707302979.534.png 707302979.535.png 707302979.536.png 707302979.538.png 707302979.539.png 707302979.540.png 707302979.541.png 707302979.542.png 707302979.543.png 707302979.544.png 707302979.545.png 707302979.546.png 707302979.547.png 707302979.550.png 707302979.551.png 707302979.552.png 707302979.553.png
lub
AktualnietametodaniejestjuŜuŜywana.
Posiadaonawieleograniczeń.Obecniezostała
zastąpionaprzezprogramykomputerowe.
KrzywaScatcharda (Rosenthala)
• Jestsłusznatylkojeślilekłączysięz
pojedyncząpopulacjąmiejscreceptorowych
•JestwraŜliwanaartefaktyeksperymentalne
Związanyradioligand
Wolnyradioligand
K D = -1/tg α
Młodyczłowieku!Maszrację!Aletojest
OgraniczeniaanalizyScatcharda
uczelniaianalizaScatcharda jestkonieczna
abenci moglizrozumiećpodstawy
Inasuwabardzo
interesującepytania
egzaminacyjne
α
Związanyradioligand (skalaliniowa)
OgraniczeniaanalizyScatcharda
Definicje
Dobrze
wymieszać
Praktyczne
przedstawienie
bindingu
Przygotowanietkankiiradioliganda
B max wyraŜananp.wpikomolach namiligrambiałka
(pmol/mgprot.)
Maksymalnailośćliganda,którawiąŜesięspecyficzniezreceptorem
wbłoniepreparatu.
Coznacząte
wszystkieliczby?
Inkubacja
K D jednostkąjestmolnalitr(np.nM)
Staładysocjacjiznakowanegoligandawyznaczonawmetodzie
wysyceniowej.OznaczastęŜenie 3 H liganda,którywstanierównowagi
procesówasocjacjiidysocjacji(equilibrium)łączysięz50%
receptorów.
Filtracja
Analizawyników
Płukanie Liczenie
WiemyjuŜ,Ŝewiązanieligandadoreceptorajestspecyficzne
Więcradioaktywnośćzwiązana
ztkankąodzwierciedlatylko
ligandzwiązanyzreceptorem
tzn.wiązaniespecyficzne?
RECEPTORY
MiejscawiąŜące
[ 3 H]ligand
OczywiścieNIE!
4
707302979.554.png 707302979.555.png 707302979.556.png 707302979.557.png 707302979.558.png
 
707302979.560.png 707302979.561.png 707302979.562.png 707302979.563.png 707302979.564.png 707302979.565.png 707302979.566.png 707302979.567.png 707302979.568.png 707302979.569.png 707302979.571.png 707302979.572.png 707302979.573.png 707302979.574.png 707302979.575.png 707302979.576.png 707302979.577.png 707302979.578.png 707302979.579.png 707302979.580.png 707302979.582.png 707302979.583.png 707302979.584.png 707302979.585.png 707302979.586.png 707302979.587.png 707302979.588.png 707302979.589.png 707302979.590.png 707302979.591.png 707302979.593.png 707302979.594.png 707302979.595.png 707302979.596.png 707302979.597.png 707302979.598.png 707302979.599.png 707302979.600.png 707302979.601.png 707302979.602.png 707302979.604.png 707302979.605.png 707302979.606.png 707302979.607.png 707302979.608.png 707302979.609.png 707302979.610.png 707302979.611.png 707302979.612.png 707302979.613.png 707302979.615.png 707302979.616.png 707302979.617.png 707302979.618.png 707302979.619.png 707302979.620.png 707302979.621.png 707302979.622.png 707302979.623.png 707302979.624.png 707302979.626.png 707302979.627.png 707302979.628.png 707302979.629.png 707302979.630.png 707302979.631.png 707302979.632.png 707302979.633.png 707302979.634.png 707302979.635.png 707302979.637.png 707302979.638.png 707302979.639.png 707302979.640.png 707302979.641.png 707302979.642.png 707302979.643.png 707302979.644.png 707302979.645.png
RECEPTORY
RECEPTORY
MiejscawiąŜące
[ 3 H]ligand
MiejscawiąŜące
[ 3 H]ligand
Wiązanieniespecyficzne
RECEPTORY
Zarówno wiązaniespecyficzne (tzn.ligandzwiązany
zreceptorem)jaki wiązanieniespecyficzne składają
sięnaradioaktywnośćktórapozostajezwiązanaz
tkankąpoodpłukaniu.
MiejscawiąŜące
„zimny”ligand
MiejscawiąŜące
[ 3 H]ligand
Odpłukiwanie pozwalatylkonausunięciewolnego
ligandaobecnegowśrodowiskuinkubacyjnym
Wiązanie
specyficzne
Ligandy
Wiązanie
niespecyficzne
Problemwiązanianiespecyficznego
JakodróŜnićwiązaniespecyficzneodniespecyficznego?
Pierwszaseriapróbek:tkanka+znakowanyligand
Wieleligandówmazdolnośćdowiązaniasię
niespecyficznieztkanką,iróŜnymi
powierzchniami,któreniesąliczonewtrakcie
procedury(np.:filtry,szkło,...)
Ligandznakowanyizotopem
Wiązanie
niespecyficzne
Wiązanie
specyficzne
Wiązanieniespecyficznedopowierzchniszklanych
ifiltrówpapierowychmoŜebyćwyeliminowaneprzy
pomocyantyadsorbantów,np.kolagenu
Tkanka
Aletakiezabieginiezmniejszająwiązanianiespecyficznego
dotkankiwczasieeksperymentu.Koniecznejestwięc
mierzeniewiązanianiespecyficznego
Związanaradioaktywność= wiązanie niespecyficzne+ specyficzne
5
707302979.646.png 707302979.648.png 707302979.649.png 707302979.650.png 707302979.651.png
 
707302979.652.png 707302979.653.png 707302979.654.png 707302979.655.png 707302979.656.png 707302979.659.png 707302979.660.png 707302979.661.png 707302979.662.png 707302979.663.png 707302979.664.png 707302979.665.png 707302979.666.png 707302979.667.png 707302979.668.png 707302979.670.png 707302979.671.png 707302979.672.png 707302979.673.png 707302979.674.png 707302979.675.png 707302979.676.png 707302979.677.png 707302979.678.png 707302979.679.png 707302979.681.png 707302979.682.png 707302979.683.png 707302979.684.png 707302979.685.png 707302979.686.png 707302979.687.png 707302979.688.png 707302979.689.png 707302979.690.png 707302979.692.png 707302979.693.png 707302979.694.png 707302979.695.png 707302979.696.png 707302979.697.png 707302979.698.png 707302979.699.png 707302979.700.png 707302979.701.png 707302979.703.png 707302979.704.png 707302979.705.png 707302979.706.png 707302979.707.png 707302979.708.png 707302979.709.png 707302979.710.png 707302979.711.png 707302979.712.png 707302979.714.png 707302979.715.png 707302979.716.png 707302979.717.png 707302979.718.png 707302979.719.png 707302979.720.png 707302979.721.png 707302979.722.png 707302979.723.png 707302979.725.png 707302979.726.png 707302979.727.png 707302979.728.png 707302979.729.png 707302979.730.png 707302979.731.png 707302979.732.png 707302979.733.png 707302979.734.png 707302979.736.png 707302979.737.png 707302979.738.png 707302979.739.png
Zgłoś jeśli naruszono regulamin