BiologiaIVRec.pdf
(
1708 KB
)
Pobierz
Microsoft PowerPoint - BiologiaIVRec.ppt
Receptory(c.d.)
GabrielNowak,MałgorzataDybała
ZakładCytobiologiiiHistochemii,
Pracownia
Pracownia
Farmakobiologii
Farmakobiologii
Collegium
Medicum
Uniwersytet
Jagielloński
Jagielloński
Zagadnienia:
Izotopy
nuklidy(jądraatomowe)otejsamejliczbie
atomowejiróŜnejliczbiemasowej,tj.ojednakowej
liczbieprotonówiróŜnejliczbieneutronównp.:
”?
Działanielekównazasadzieinterakcji
Radioligand
binding
binding
assay
assay
”?
12
C,
14
C;
1
H(wodórzwykły),
2
H(deuter),
3
H(tryt)
Działanielekównazasadzieinterakcji
ligand
receptor
Podstawowewłaściwościwiązanialigand
Podstawowewłaściwościwiązanialigand
–
receptor
Izotoppromieniotwórczy,radioizotop
– izotopdanego
pierwiastka,któregojądrawykazujązdolnośćsamorzutnej
przemianyzemisjąpromieniowaniajonizującego.
receptor
jestefektemniestabilnegoukładu
protonówineutronówwjądrze,któreulegasamorzutnemurozpadowi
wceluosiągnięcianiŜszego(bardziejkorzystnego)stanuenergetycznego.
Takistanjestosiąganyprzezemisjęcząstekalfalubbeta.
Radioligand
binding
binding
assays
assays
tojądraatomuhelu,składającesięzdwóchprotonówidwóch
neutronów.
A
X→
A4
X+
4
He
Z
Ligandznakowanyradioizotopem
Z22
toelektronyemitowanezjąder(neutron→ elektron+proton+v
)
A
X→
A
X+β
+v
Z
Z+1
3
H,
125
I,...
tofaleelektromagnetyczne,któretowarzyszyemisji
cząstekalfalubbeta
1
ZakładCytobiologiiiHistochemii,
Collegium
Medicum
Uniwersytet
Coznaczy„
Coznaczy„
Radioligand
ligand–
receptor
Radioligand
Radioligand
binding
binding
assays
assays
Receptorymetabotropowe
SązwiązanezsystememwtórnychprzekaźnikówzapośrednictwemGTP.
Przyłączenieendogennegoliganda(agonisty)domiejscawiązaniainicjuje
kaskadęsygnałówwewnątrzkomórkowych(np.przezfosforylację)
Wiązanieligandadokomponentybiałkowej
Neurotransmitery
Hormony
Czynnikiwzrostu
Cytokiny
Leki
Toksyny
..........
Efektor
Receptory
Kanałyjonowe(VS)
Enzymy
Cząstkitransportujące
(VS)=Voltage sensitive
BiałkoG
Receptoryjonotropowe =kanałyjonowebramkowaneligndem
Podstawydziałanialeków:interakcjaligand receptor
Wtymprzypadkuefektor
(bramka)jestczęścią
receptora
!
Przyłączenie
neurotransmitera
Wielelekówmusiwiązaćsięzreceptoremabywywołaćefekt.
Takielekisą
ligandami.
Bramkowanieligandem oznacza,Ŝe
dootwarciakanałukoniecznejest
przyłączeniespecyficznegotransmitera
(agonisty)dozewnątrzkomórkowejczęści
receptora.
Otwarcie
kanału
Jeśliefektemwiązanialigandadomiejscawiązania
sązmiany konformacyjneiodpowiedźkomórkowa
totakiligandjest
agonistą.
Zajęciemiejscarozpoznaniaprzez
endogennyligand(agonistę)prowadzido
napływujonówprzezbłonękomórkową.
Wpływjonów
przezbłonę
PrzyłączenieligandadomiejscawiązaniamoŜeniepowodować
odpowiedzikomórkowej.Jakkolwiek,zajęcietegomiejscaczynije
niezdolnymdoprzyłączaniainnychligandów,m.in.endogennych
agonistów.Wtymprzypadkuligandnazywamy
antagonistą.
Matematycznemodelowanieodwracalnegowiązanialiganda
!
Wiązanieligandadomiejscawiązanianareceptorze
niezawszepociągazasobąodpowiedź
wewnątrzkomórkową.
KaŜdacząstkaliganda(L)moŜetworzyćzreceptorem(R)
kompleksligand– receptor(LR)
!
Wiązanieligandadoreceptorajesttylkojednym
aspekteminterakcjiligand– receptor.
[L]+[R]
[LR]
Radioligand binding assay dostarczainformacjitylkoo
powinowactwieligandadomiejscawiązania.
Tenkompleks(LR)moŜewkaŜdymmomencieulecrozpadowi,wwynikuczego
powstajewolnacząstkaliganda(L)iniezwiązanyreceptor(R).
Wniosek:
wcelusprawdzenia,czyligandjestagonistą,czyantagonistą
koniecznejestprzeprowadzenietestówfunkcjonalnych.
2
Radioligand
Reakcjawiązanialiganda(L)zreceptorem(R)przebiegazgodnie
zprawemdziałaniamas(Guldberga iWaagego)
Dlaczego?
K
D
[LR]=[L][R]
jeststałe
gdzieK
D
jeststałądysocjacji.
K
D
zaleŜyodczynnikówfizycznychjaktemperaturaiod
chemicznychwłaściwościsubstancji.
Zaczekaj!
TosamorównaniemoŜebyćstosowanedlabardziejskomplikowanych modeli,
wktórychRiLRmogąmiećwielorakiekonformacje.
Pomyśl!
PoniewaŜcałkowitaliczbareceptorów
(wpreparacie)jestograniczona
Jeśliwiązanieliganda(klucza)do
komponentybiałkowej(receptora)wymaga
odpowiedniegodopasowaniapomiędzy
strukturąligandaamiejscem
wiązania(zamkiem)totakainterakcjajest
specyficzna.
Więcjakiejestwiązanie(binding)dotejograniczonejliczbyreceptorów?
wysycalne
Wiązaniedoreceptorówjest
STEREOSPECYFICZNE
Wiązaniedoreceptorówjestwysycalne (saturable)
Miejscewiązania
Jeślireceptorysąobecnewograniczonejilości,toprzypewnymstęŜeniu
ligandawszystkiereceptorysązwiązaneikrzywawiązaniaosiąga plateau.
Wiązanieligandadoreceptorajestspecyficzneiwysycalne
Wiązaniecałkowite
dladwóchligandów
AiB
Wiązanie
jako%
maksymalnego
wiązaniaspecyficznego
Wracającdomodelowaniamatematycznego:
[L]+[R][LR]
Bmax
.....................................................................
...................................................................
.....................................................................
Wiązaniemaksymalne
JednacząstkaligandawiąŜesięzjednymreceptorem(miejscemwiąŜącym
ligand)wsposóbodwracalny zokreślonymiszybkościamiwiązania
(asocjacji)irozpadu(dysocjacji).Reakcjawiązanialiganda(L) zreceptorem(R)
przebiegazgodniezprawemdziałaniamas.
K
D
.............................
K
D
[LR]=[L][R]
gdzieK
D
jeststałądysocjacji
...
............
[nM]
...................
3
lub
AktualnietametodaniejestjuŜuŜywana.
Posiadaonawieleograniczeń.Obecniezostała
zastąpionaprzezprogramykomputerowe.
KrzywaScatcharda (Rosenthala)
• Jestsłusznatylkojeślilekłączysięz
pojedyncząpopulacjąmiejscreceptorowych
•JestwraŜliwanaartefaktyeksperymentalne
Związanyradioligand
Wolnyradioligand
K
D
=
-1/tg α
Młodyczłowieku!Maszrację!Aletojest
OgraniczeniaanalizyScatcharda
uczelniaianalizaScatcharda jestkonieczna
abenci moglizrozumiećpodstawy
Inasuwabardzo
interesującepytania
egzaminacyjne
α
Związanyradioligand (skalaliniowa)
OgraniczeniaanalizyScatcharda
Definicje
Dobrze
wymieszać
Praktyczne
przedstawienie
bindingu
Przygotowanietkankiiradioliganda
B
max
wyraŜananp.wpikomolach namiligrambiałka
(pmol/mgprot.)
Maksymalnailośćliganda,którawiąŜesięspecyficzniezreceptorem
wbłoniepreparatu.
Coznacząte
wszystkieliczby?
Inkubacja
K
D
jednostkąjestmolnalitr(np.nM)
Staładysocjacjiznakowanegoligandawyznaczonawmetodzie
wysyceniowej.OznaczastęŜenie
3
H
liganda,którywstanierównowagi
procesówasocjacjiidysocjacji(equilibrium)łączysięz50%
receptorów.
Filtracja
Analizawyników
Płukanie
Liczenie
WiemyjuŜ,Ŝewiązanieligandadoreceptorajestspecyficzne
Więcradioaktywnośćzwiązana
ztkankąodzwierciedlatylko
ligandzwiązanyzreceptorem
tzn.wiązaniespecyficzne?
RECEPTORY
MiejscawiąŜące
[
3
H]ligand
OczywiścieNIE!
4
RECEPTORY
RECEPTORY
MiejscawiąŜące
[
3
H]ligand
MiejscawiąŜące
[
3
H]ligand
Wiązanieniespecyficzne
RECEPTORY
Zarówno
wiązaniespecyficzne
(tzn.ligandzwiązany
zreceptorem)jaki
wiązanieniespecyficzne
składają
sięnaradioaktywnośćktórapozostajezwiązanaz
tkankąpoodpłukaniu.
MiejscawiąŜące
„zimny”ligand
MiejscawiąŜące
[
3
H]ligand
Odpłukiwanie pozwalatylkonausunięciewolnego
ligandaobecnegowśrodowiskuinkubacyjnym
Wiązanie
specyficzne
Ligandy
Wiązanie
niespecyficzne
Problemwiązanianiespecyficznego
JakodróŜnićwiązaniespecyficzneodniespecyficznego?
Pierwszaseriapróbek:tkanka+znakowanyligand
Wieleligandówmazdolnośćdowiązaniasię
niespecyficznieztkanką,iróŜnymi
powierzchniami,któreniesąliczonewtrakcie
procedury(np.:filtry,szkło,...)
Ligandznakowanyizotopem
Wiązanie
niespecyficzne
Wiązanie
specyficzne
Wiązanieniespecyficznedopowierzchniszklanych
ifiltrówpapierowychmoŜebyćwyeliminowaneprzy
pomocyantyadsorbantów,np.kolagenu
Tkanka
Aletakiezabieginiezmniejszająwiązanianiespecyficznego
dotkankiwczasieeksperymentu.Koniecznejestwięc
mierzeniewiązanianiespecyficznego
Związanaradioaktywność=
wiązanie niespecyficzne+
specyficzne
5
Plik z chomika:
aneka881
Inne pliki z tego folderu:
BiologiaII.pdf
(2755 KB)
BiologiaIVRec.pdf
(1708 KB)
biolmolczynnikitranskrypcyjne.pdf
(1793 KB)
skrypt_fotosynteza.pdf
(2180 KB)
biologia_wyklad_04.pdf
(161 KB)
Inne foldery tego chomika:
cytofizjologia
histologia i cytologia
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin