Nowe strategie wykorzystania wektorów plazmidowych i wirusowych w terapii genowej.pdf

PRACE PRZEGLDoWE

wektorw planmidorych i wirusorych

w terapii genowei

Alicj a Jozkowi cz, J6zef Dulak

Zakad Bioteclrno|ogii Medycznej, Wydzial Biochemii, Biofizyki i Bio.

teclrnologii, Uniwel.sytet Jagielloliski, Krakw

New strategies for application of plasmid and viral vectors in gene

therapy

S u m m a rv

The success of gene therapy depends on development of efficient and safb

delivery vectors. Recently, significant progres.s has been achieved in application

of various non-viral delivery methods and numerous modified virarl vectors for

experimental gene therapy. Some of those vectors have been also successfully

usecl in clinical trials of gene therapy. Further progress in rhis still promising, al-

though not-fulfilling all expectations, treatment is dependent on the careful

evaluation of the modes of transgene delivery and regulation of transgene ex-

pression in the diseased tissues. In this review the cun'ent progress in develop-

ment of some of the tools for therapeutic gene transfbr is discussed.

Adres do korespondencii

A|icja Jzkowicz,

ZaWad Biotcchnologii

Mcd,vczncj,

Wydziat Biochemii,

Biofizvki i Biotechnologii,

Uniwersytet J agiel I oriski,

uf . Gronostaiowa 7,

:3t-z71 kakw;

e-mail:

alicia@mol.uj.edu.pl

Key words:

gene therapy, adenoviral vectors, AAV vectors, plasmid vectors, regulable

transgene expression.

1. TVstp

Transformacja genetyczna komorek eukariotycznych prze-

prowadzona zostala po raz pierwszy w roku 1962 przez Eliza-

beth i Wacawa Szyba|skich, practrjqcych na Uniwersytecie Wi-

sconsin. Stosujqc roztwor fosforanu Wapnia Wprow adzi|i orri

fragmenty DNA genomowego do ludzkich komorek szpikr,r. Ba-

dacze ci Sq rwniez autoranri ternrinu ,,terapia genowa'' (J).

biotechnologio

3 (78) 7-2r 20A7

Nowe strategie rykorzyst ania

A|icja Jzkowicz, J6zef Du|ak

Terapia genowa to |eczenie chorb za pomoc kwasw nukleinowych' Ta szeroka

definicja obejmuje terapeutyczne wykorzystywanie zarwno genw jak i krtszych,

niekodujcych sekwencji DNA lub RNA' W zalenoci od rodzaju choroby dy si

bqddo naprawy wady genetycznej poprzez wprowadzenie do komrek prawid|owej

postaci zmutowanego genu, bd tei prbuje si modyfikowa aktywno poszcze.

g|nych genw. W tym drugim przypadku terapia moe polega na wprowadzaniu do-

datkowych kopii, a przezto wzmacnianiu dziaania tych genw, ktre nie funkcjonuj

wystarczajco wydajnie. Moe rwnie zmierza do zahamowania aktywnoci genw,

ktrych nadnrierna ekspresja jest przyczyr clrorb' To w|anie w hamujcej terapii

genowej wykorzystuje si take niekodujce sekwencje DNA lub RNA.

opracowano wiele technik wprowadzania kwasw nuk|einowyclr do komrek'

zarwno in vitro jaki in vivo (2,3\.Bez wzgldu na zastosowanq metod, wprowadza-

ny do komrki materia genetyczny napotyka podobne przeszkody, ktre musi po-

kona. Pierwsz z nich jest przeniknicie przez plazmalemm. Ma ona ladunek

ujemny, podobnie jak DNA czy RNA, co bardzo utrudnia przylgnicie kwasw nukle-

inowych do powierzchni komrki. Co wicej, zarwno DNA jak i RNA s hydrofi|o-

we, co uniemo|iwia ich wnikanie na drodze fuzji z |ipidow bon (3).

Aby stransformowa komrk musimy a|bo spowodowa powstanie w blonie po-

rw albo posuy si nonikami uatwiajcymi wniknicie DNA czy RNA do komrki

na zasadzie fuzji z blon lub fagocytozy' Jeli material genetyczny poczony z no-

nikiemjest dostarczany dziki fuzji z plazmalemm - gromadzi si w cytoplazmie

pod blon. RNA moe podj swoje funkcje ju tutaj, jednak DNA - znacznie cz-

ciej stosowany do transformacji - musi przedosta si do jdra. Transport ten jest

bardzo mao wydajny i zdecydowana wikszoczsteczek zostaje strawiona w cy.

top|azmie. Najczciej jednak materia| genetyczny zwizany z nonikamiwnika do

komrki nie dziki fuzji,|ecz na drodze endocytozy. Wwczas poczqtkowo loka|izu-

je si w endosomach, co stanowi dodatkowq trudno, gdy moe w nich zosta

szybko zniszczony przez nuk|eazy. Genera|nie, przy zastosowaniu wikszoci me-

tod wprowadzenie DNA lub RNA do wntrza komrkijest stosunkowo proste, nato-

miast o skutecznoci transformacji decyduje efektywnouwalniania kwasu nuk|e-

inowego z endosomtl i wydajnotransportu DNA do jdra (3'4).

W wikszoci przypadkw DNA wprowadzony do transformowanych komrek

pozostaje w jdrze jako element episoma|ny i nie wbudowuje si do chromosomw

gospodarza. Utrzymuje si na niezmienionym poziomie zwyk|e od kilkunastu go-

dzin do kilku dni, a nastpnie jest stopniowo degradowany. Ponadto, w trakcie po-

dziau komrki egzogenny DNA nie replikuje ijest przekazywany ty|ko do niekt-

rych komrek potomnych' Ekspresja transgenu wystpujqcego w formie episoma|-

nej moe by znacznie d|uisza in vivo w komrkach nie dzie|qrych si, np. mi.

niachszkieletowych i miniu sercowym czy w komrkach dzie|rych si rzadko,

takich jak hepatoryty (3).

Na|ey pamita, e s wektory - przede wszystkim wektory retrowirusowe

i |entiwirusowe, ktre wbudowuj transgen do chromosomw gospodarza, pozwa-

PMCE PRZEGI4DOWE

Nowe strategie wykorzyst.ania wektorw plazmidowych i wirusowych w terapii genowej

Iajqc na jego stabilnq. ekspresj (2). Wprowadzony DNA nie jest degradowany, |ecz

ulega replikacji wraz z DNA genomowym ijest przekazywany wszystkim komrkom

Potomnym. |ntegracja transgenu z DNA gospodarza zdarza si rwnie przy wyko-

rzystaniu innych wektorw, np. plazmidw lub wektorw adenowirusowych, a|e

proces ten jest bardzo malo wydajny ijego czstowaha si od -l na 100 do 1 na

1000 stransdukowanych komrek (2,4).

Wbudowanie transgenu do endogennego DNA komrki pozwa|a na uzyskanie

d|ugotrwaego efektu biologicznego, bywa zatem zjawiskiem bardzo podanym.

Moe jednak prowadzi take do skutkw ubocznych, wywolujc znriany w funkcjo-

nowaniu genw gospodarza' Jedn z korrsekwencji nroe by urrieczynnienie genu

na skutek wbudowania transgenu w obrb sekwencji kodujcej lub w miejsca regu-

|atorowe. lnsercja moe te wywolywa jednoczesnq de|ecj dlugich fragmentw

DNA genomowego |ub zmienia wz6r jego mety|acji. Jednoczenie, jeli transgen

jest regulowany przez si|ny promotor (zwaszcza przez sekwencje promotorowe

LTR wektorw retrowirusowych)jego obecnomoe aktywowa ekspresj genw

pooonych w pob|iu insercji (5).

Podstawowym narzdziem stosowanym do sklonowania i namnoenia transgenu

s plazmidy' S one niezbdne do uzyskania kadego, nawet najbardziej Zaawanso-

wanego wektora stosowanego w terapii genowej. Mog rwnieby wykorzyswa-

ne bezporednio jako nonik wprowadzajcy transgen do komrki.

Wk|onowanie wybranego genu do p|azmidu wykonuje si najczciejwykorzy-

stujc obecrre w p|azmidzie miejsca rozPoznawane i cite przez enzymy restrykryj-

ne. Zgrupowane s one zazwyczaj w segmencie okre|anyn jako polilinker (MCS,

ang' multi-cloning site). Aby wklonowany DNA ulega ekspresji w komrkach eukario-

tycznych, konieczne jest podczenie go do sekwencji promotorowych. Najprostszy-

mi i najczciej stosowanymi promotorami s sekwencje DNA pochodzenia wiruso.

wego' np. promotor ludzkiego wirusa cytomega|ii (CMV) bd matpiego wirusa

SV40. Coraz czciej uywane s rwnie promotory pochodzce z komrek euka.

riotycznych, zwykle z genw konstyttrwnych, takich jak gen B.g|obiny, aktywnych

we wszystkich typach komrek. Szczeglnie obiecujce jest jednak stosowanie pro-

motorw tkankowospecyficznych, dziki ktrym ekspresja transgenu zachodzi ty|-

ko w wybranych komrkach. Mona te wykorzystywa promotory, ktryclr aktyw-

no jest regu|owana, np, przez antybiotyki lub obnione stenie tlenu w tkance

(6,7).

Plazmidy stosowane w dochczasowych prbach terapii genowej najczciej za-

wieraly jeden transgen terapeuczny, okazuje si jednak, ze z|ozony charakter

chorb moe wymaga zwikszania ekspresji wikszej liczby genw. Wykorzystuje

si wwczas tzw. p|azmidy policistronowe. W wektorach takich ekspresja drugiego

genu terapeutycznego moe by regulowana przez sekwencj IRES (ang. internal ri-

bosome entry site), umoIiwiajc translacj mRNA niezalen od czapeczki 5'. Brak

jednak jednoznacznych danych dotyczcych efektywnoci takich wektorw, ktra

w przypadku genu zalenego od |RES moe by nisza (8).

BToTECHNOLOGTA 3 (781 7-21 2OO7

A|icja Jzkowicz, J6zef Du|ak

2. Narzdzia terapii genowej

W niektrych przypadkach, aby wprowadzi material genetyczny do organizmu,

wystarczy wstrzykn do tkanki roztwr DNA p|azmidowego w so|i fizjo|ogicznej.

Jest to tzw. nagi DNA. Jego wykorzystanie jako nonika ma wiele za|et. P|azmidy s

bowiem proste i tanie w produkcji, a ich podanie do organizmu wywohlje znikome

efekty uboczne, ograniczone zwyk|e do niewielkiego odczynu zapalnego. Mona

w ten sposb uzyska transformacj miniszkieletowych i kardiomiocytw oraz

rriektrych komrek skry' Duq wydajnotransfekcji nagim DNA i wysoki poziom

ekspresji transgenu uzyskiwano w dowiadczeniachprowadzanych na myszach' Na-

ley jednak zaznaczy, e w wielu badaniaclr poddaje si w wtpliwoefektywno

tej metody u ludzi. Opisywane np. efekty lecznicze w terapii choroby niedokrwien-

nej serca za pomocq' wektorw p|azmidowych z genami smu|ujrymi powstawanie

naczyti krwiononych sq zapewne wynikiem samego zabiegu, a nie ekspresji trans-

genw, ktra jest bardzo niska przy wykorzystaniu nagiego DNA u ludzi (1,9)'

obecnie testowanych jest wiele technik majcych na celu zwikszenie skutecz-

nocidostarczania plazmidw do tkanek. Jecln z nich jest tzw' metoda hydrodyna-

miczna. Polega ona na szybkim wstrzykniciu do krwi duej objtociplynu zawie-

rajcego plazmidowy DNA. oznaczato,ze myszywacej okolo 20 g podaje si do

yly ogonowej w cigtl kilku sekund ponad 1,5 mL soli fizjo|ogicznej zawierajcej

5 pg p|azmidu. Ekspresj genu wprowadzonego w p|azmidzie obserwuje si zwlasz-

cza w wtrobie, ale take w innych tkankach (l0). Zastosowanie tej metody w tera-

pii genowej czowieka wymaga optymalizacji sposobu podawania plynu w taki spo-

sb, by nie dosz|o do uszkodzenia narzq,dw. obecnie szanse na zastosowanie tej

techniki w praktyce k|inicznej sq' jednak znikome'

Podawanie nagiego DNA do wikszoci tkanek jest nieskuteczne. Nie mona go

rwnie wprowadza do komrek hodowanych in vitro. W tym przypadku trzeba

uy ktr z metod fizycznych, biochemicznych lub biologicznych, u|atwiajcych

transformacj.

Metody fizyczne pozwalaj na wprowadzenie kwasu nuk|einowego do cytop|a-

zmy lub do jqdra komrkowe8o popruez lokalne i odwracalne uszkodzenie blony.

Najczciej stosowan procedur jest elektroporacja, po|egajca na poddaniu ko-

nrrek dzialaniu krtkotrwalego impulsu elektrycznego o wysokim napicitl. Prowa.

dzi to do tworzenia si w p|azma|emmie porw o nanonretrowej rednicy, ktre za-

nikaj spontanicznie po okolo 30 minutach. Material genetyczny moe wnika do

komrek albo w czasie gdy pory s otwarte, a|bo na skutek przemieszczania si

sktadnikw blony komrkowej przy ich zamykaniu. Elektroporacja bywa wyjqtkowo

skuteczna, take w komrkach do ktrych bardzo trudno wprowadzi transgeny in-

nymi metodami. Czsto wie si jednak z powanym uszkodzeniem komrek.

Pocztkowo bya stosowana tylko in vitro, ale od pewnego czasLl, dziki opracowa-

niu odpowiednich urzdzeil, moliwe jest wspomaganie poprzez elektroporacj

transf.eru nagiego DNA do skry, miniszkieletowych czy nawet wtroby (10).

PRACE PRZEGDOWE

Nowe strategie wykclrzystania wektorow plazmidowych i wirusowych w terapii genowej

Metody biochemiczne opieraj si na zastosowaniu chemicznych nonikw two-

rzq-rych kompleksy z kwasami nuk|einowymi. Najczciej wykorzystywanymi noni-

kami s |ipidy kationowe (|iposomy kationowe) lub poIimery aminowe (oligodendry-

mery), ktre pozwalaj zneutralizowa ujemny |adunek kwasw nuk|einowych.

Kompleksy dostajq si do komrki na drodze fagocytozy |ub _ rzadziej - fuzji

z blon komrkow. Niektre z nonikw uatwiajq rwnie uwolnienie kwasu nu-

kleinowego z endosomu do rytop|azmy i chroni go przed aktywnoci nukleaz

(2,l0).

Pierwszym zastosowanym nonikiem clremicznym ulatwiajqcym transformacj

genetyczn in vitro byt fosforan wapnia ( l ). Jest on czsto uywany rwnie obecnie,

zw|aszcza przy wprowadzaniu jednoczenie kilku plazmidw do szybko dzielcych

si linii komrkowych' Efektywnotransdukcji hodowli pierwotnych jest jednak

z reguly bardzo saba. Znacznie droszymi, a|e te zwykle skuteczniejszymi noni-

kami s lipidy kationowe, czsto |czone z lipidami obojtnymi. Sq- one malo tok-

syczne' mog jednak wywoywa aktywacj niektrych komrek i indukowa pro.

dukcj cytokin pozapalnych (1,2,1o\.

Liposomy mona te stosowa do dostarczania p|azmidw in vivo. Po doy|nym

wstrzyknicir.l liposomw wikszoplazmidowego DNA trafia do puc i wtroby,

wykrywa si go jednak take w innych narzdach, np. ledzionie. W organizmie roz-

prowadzanie i skuteczne wykorzystanie |ipop|eksw jest ograniczone poprzez w-

stpowanie rozmaitych barier. We krwi komp|eksy naraone s na wychwycenie

przez komrki fagocytujqce, DNA na strawienie przez nukleazy, a wikszo p|azmi-

dw i tak nie dociera do konlrek, gdy zostaje zatrzymana w macierzy pozakomr-

kowej. Lipopleksy, w porwnaniu z wektorami wirusowymi s wic stosunkowo

malo efektywne, mniej stabi|ne i osiq,gana paprzez ich zastosowanie ekspresja

transgenu jest krtkotrwala. Mog te indukowa odpowied zapaln'

W dowiadczeniach klinicznych |ipopleksy wykorzystywane s nieco rzadziej

anie|i nagi plazmidowy DNA. Stosowano je np. do wprowadzania plazmidu z ge-

nem bialka kanau jonowego CFTR do nabonka drg oddechowych pacjentw cho-

rych na mukowiscydoz. obecnie testuje si je w terapii przeciwnowotworowej

a take w niektrych prbach |eczenia schorze ukladu krenia (1'9,1-l-17).

Wydajno transfekcji za pomocq |iposomw mona zwikszy, dodajc do no-

nika tuszczowego ligandy wice si z receptorami wystpujrymi na powierzch.

ni komrek.Jednym z takic|r ligandw jest asia|og|ikoproteina, wizca si z recep-

torem obecnym na hepatocytach. Zastosowanie sekwencji RGD poprawia natonriast

skutecznotransfekcji do komrek rblonka, a polczenie liposomw z przeciw-

ciaem przeciwko selektynie E umoliwia zwikszenie transfekcji pobudzonych ko-

mrek rdblonka, np. w guzie nowotworowym. Jednym z bardziej efektywnych

sposobw okazalo si poczenie liposomw z bialkami oslonki wirusa gorczkija-

poIiskiej (HVJ, ang. heamaglutinin virus of Japan\' Noniki takie, zwane wiropleksami,

wykorzystano m.in. do dostarczania plazmidw do komrek cianynaczyil krwiono-

nych (18).

BToTECHNOLOGTA 3 (78) 7-21 2007

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: